發(fā)布時間：2017-04-04 14:11

  本文關鍵詞：煙曲霉Hsp70和Hyp1基因的克隆與表達研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：自然界存在10萬多種真菌,僅有300多種能抵抗人類的體表溫度引起感染,尤其是免疫功能低下者或是生命垂危患者。目前感染的主要病原菌仍然是念珠菌,但曲霉菌、隱球菌等也在不斷增加,尤其是曲霉菌,估計全球每年有20萬侵襲性曲霉感染(IA)病例,雖然曲霉菌的感染率僅次于念珠菌,但是其死亡率卻遠高于念珠菌感染,達40%~90%。曲霉菌屬中以煙曲霉感染致病最為常見,占IA的90%~95%,這主要歸因于其無處不在的分生孢子。IA的高發(fā)病率和死亡率,決定了其早期診斷及時治療的重要意義和價值。由于缺乏快速準確的診斷方法,加上IA患者早期臨床癥狀不明顯,往往延誤了最佳的治療時機。近年來,由于分子生物學和免疫學的飛速發(fā)展,越來越多的研究者把目光聚集在血清學檢測,以期找到特異的抗原或抗體系統(tǒng)。本研究在課題組前期比較蛋白質組學的基礎上,篩選煙曲霉細胞壁蛋白熱休克蛋白70(Hsp70)和疏水蛋白(Hyp1)為目標,通過Gen Bank查找其基因序列,擬構建煙曲霉Hsp70和Hyp1基因的重組質粒,在原核表達載體大腸桿菌中誘導表達,為后續(xù)探討Hsp70和Hyp1抗原、抗體系統(tǒng)在診斷侵襲性煙曲霉感染中的價值和意義奠定基礎。根據(jù)Genbank報道的煙曲霉Hsp70和Hyp1基因序列,設計特異引物,以煙曲霉IFM40808的c DNA為模板,PCR擴增目的基因;通過基因的克隆與亞克隆,將目的基因與表達質粒Pet28a(+)連接;將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,用異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導目的基因的表達,通過SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物;純化表達產(chǎn)物并進行Western-blot定性分析和BCA定量分析。結果:1.經(jīng)PCR分別擴增出1366bp和769bp的Hsp70和Hyp1基因核苷酸序列與Gen Bank中公布的序列基本一致。2.構建了含重組質粒p ET28a(+)-Hsp70和p ET28a(+)-Hyp1的大腸桿菌工程菌,經(jīng)IPTG誘導目的基因表達,SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物的大小與預期基本一致。3.對包涵體形式的目的蛋白Hsp70,進行變性溶解和復性,獲得比較均一的目的蛋白。4.Western-blot分析誘導表達的目的蛋白Hsp70和Hyp1能與抗His-tag的小鼠單抗相互結合,BCA定量分析目的蛋白Hsp70濃度為900ug/m L。結論:1.構建了煙曲霉Hsp70和Hyp1基因的原核表達質粒p ET28a(+)-Hsp70和p ET28a(+)-Hyp1。2.Hsp70和Hyp1基因的原核表達質粒在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達目的蛋白。為下一步研究其在鑒定診斷侵襲性煙曲霉感染中的作用和地位奠定了基礎。
【關鍵詞】：煙曲霉 熱休克蛋白70 疏水蛋白 克隆 表達
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R379
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文縮略詞10-11
• 第一章 緒論11-21
• 1.1 侵襲性曲霉感染概述11-12
• 1.2 侵襲性曲霉感染診斷研究進展12-16
• 1.2.1 痰培養(yǎng)12
• 1.2.2 組織病理學檢查12
• 1.2.3 影像學檢查12-13
• 1.2.4 新型檢測方法13-14
• 1.2.5 血清學檢測14-16
• 1.3 煙曲霉熱休克蛋白Hsp7016-17
• 1.4 煙曲霉疏水蛋白Hyp117-18
• 1.5 包涵體18-20
• 1.5.1 包涵體的形成機制18-19
• 1.5.2 包涵體的優(yōu)勢19
• 1.5.3 包涵體的復性19-20
• 1.6 研究目的和意義20
• 1.7 研究內容20-21
• 第二章 煙曲霉Hsp70基因的克隆、表達及表達產(chǎn)物的純化21-44
• 2.1 實驗材料21-25
• 2.1.1 菌株和質粒21
• 2.1.2 PCR引物設計與合成21
• 2.1.3 主要儀器設備21-22
• 2.1.4 主要試劑22-23
• 2.1.5 主要試劑和培養(yǎng)基的配制23-25
• 2.2 實驗方法25-35
• 2.2.1 煙曲霉Hsp70基因的擴增25-27
• 2.2.2 克隆載體pMD19T- Hsp70的構建27-30
• 2.2.3 原核表達載體pET28a- Hsp70的構建30-31
• 2.2.4 Hsp70的誘導表達31
• 2.2.5 溶解包涵體31-32
• 2.2.6 純化表達蛋白32-33
• 2.2.7 純化蛋白定性定量分析33-35
• 2.3 結果與分析35-42
• 2.3.1 煙曲霉Hsp70基因的擴增35
• 2.3.2 鑒定pMD19T- Hsp70陽性克隆35-38
• 2.3.3 重組質粒pET28a- Hsp70的鑒定38-40
• 2.3.4 Hsp70的表達40-42
• 2.4 討論42-44
• 第三章 煙曲霉Hyp1基因的克隆表達及表達條件優(yōu)化44-51
• 3.1 實驗材料44
• 3.2 實驗方法44-45
• 3.3 結果45-50
• 3.3.1 煙曲霉Hyp1基因的擴增45-46
• 3.3.2 鑒定pMD19T- Hyp1陽性克隆46-47
• 3.3.3 重組質粒pET28a- Hyp1的鑒定47-48
• 3.3.4 Hyp1的表達48-49
• 3.3.5 Western-blot分析目的蛋白49
• 3.3.6 誘導條件的優(yōu)化49-50
• 3.4 討論50-51
• 第四章 討論51-53
• 第五章 結論53-54
• 參考文獻54-62
• 作者簡介及在學期間所取得的科研成果62-63
• 致謝63

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  本文關鍵詞：煙曲霉Hsp70和Hyp1基因的克隆與表達研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：285664