本文關(guān)鍵詞：煙曲霉Hsp70和Hyp1基因的克隆與表達(dá)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：自然界存在10萬(wàn)多種真菌,僅有300多種能抵抗人類(lèi)的體表溫度引起感染,尤其是免疫功能低下者或是生命垂�；颊摺Ｄ壳案腥镜闹饕≡匀皇悄钪榫�,但曲霉菌、隱球菌等也在不斷增加,尤其是曲霉菌,估計(jì)全球每年有20萬(wàn)侵襲性曲霉感染(IA)病例,雖然曲霉菌的感染率僅次于念珠菌,但是其死亡率卻遠(yuǎn)高于念珠菌感染,達(dá)40%~90%。曲霉菌屬中以煙曲霉感染致病最為常見(jiàn),占IA的90%~95%,這主要?dú)w因于其無(wú)處不在的分生孢子。IA的高發(fā)病率和死亡率,決定了其早期診斷及時(shí)治療的重要意義和價(jià)值。由于缺乏快速準(zhǔn)確的診斷方法,加上IA患者早期臨床癥狀不明顯,往往延誤了最佳的治療時(shí)機(jī)。近年來(lái),由于分子生物學(xué)和免疫學(xué)的飛速發(fā)展,越來(lái)越多的研究者把目光聚集在血清學(xué)檢測(cè),以期找到特異的抗原或抗體系統(tǒng)。本研究在課題組前期比較蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)上,篩選煙曲霉細(xì)胞壁蛋白熱休克蛋白70(Hsp70)和疏水蛋白(Hyp1)為目標(biāo),通過(guò)Gen Bank查找其基因序列,擬構(gòu)建煙曲霉Hsp70和Hyp1基因的重組質(zhì)粒,在原核表達(dá)載體大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá),為后續(xù)探討Hsp70和Hyp1抗原、抗體系統(tǒng)在診斷侵襲性煙曲霉感染中的價(jià)值和意義奠定基礎(chǔ)。根據(jù)Genbank報(bào)道的煙曲霉Hsp70和Hyp1基因序列,設(shè)計(jì)特異引物,以煙曲霉IFM40808的c DNA為模板,PCR擴(kuò)增目的基因;通過(guò)基因的克隆與亞克隆,將目的基因與表達(dá)質(zhì)粒Pet28a(+)連接;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,用異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)目的基因的表達(dá),通過(guò)SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物;純化表達(dá)產(chǎn)物并進(jìn)行Western-blot定性分析和BCA定量分析。結(jié)果:1.經(jīng)PCR分別擴(kuò)增出1366bp和769bp的Hsp70和Hyp1基因核苷酸序列與Gen Bank中公布的序列基本一致。2.構(gòu)建了含重組質(zhì)粒p ET28a(+)-Hsp70和p ET28a(+)-Hyp1的大腸桿菌工程菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)目的基因表達(dá),SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物的大小與預(yù)期基本一致。3.對(duì)包涵體形式的目的蛋白Hsp70,進(jìn)行變性溶解和復(fù)性,獲得比較均一的目的蛋白。4.Western-blot分析誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白Hsp70和Hyp1能與抗His-tag的小鼠單抗相互結(jié)合,BCA定量分析目的蛋白Hsp70濃度為900ug/m L。結(jié)論:1.構(gòu)建了煙曲霉Hsp70和Hyp1基因的原核表達(dá)質(zhì)粒p ET28a(+)-Hsp70和p ET28a(+)-Hyp1。2.Hsp70和Hyp1基因的原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)目的蛋白。為下一步研究其在鑒定診斷侵襲性煙曲霉感染中的作用和地位奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：煙曲霉 熱休克蛋白70 疏水蛋白 克隆 表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R379
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文縮略詞10-11
• 第一章 緒論11-21
• 1.1 侵襲性曲霉感染概述11-12
• 1.2 侵襲性曲霉感染診斷研究進(jìn)展12-16
• 1.2.1 痰培養(yǎng)12
• 1.2.2 組織病理學(xué)檢查12
• 1.2.3 影像學(xué)檢查12-13
• 1.2.4 新型檢測(cè)方法13-14
• 1.2.5 血清學(xué)檢測(cè)14-16
• 1.3 煙曲霉熱休克蛋白Hsp7016-17
• 1.4 煙曲霉疏水蛋白Hyp117-18
• 1.5 包涵體18-20
• 1.5.1 包涵體的形成機(jī)制18-19
• 1.5.2 包涵體的優(yōu)勢(shì)19
• 1.5.3 包涵體的復(fù)性19-20
• 1.6 研究目的和意義20
• 1.7 研究?jī)?nèi)容20-21
• 第二章 煙曲霉Hsp70基因的克隆、表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化21-44
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-25
• 2.1.1 菌株和質(zhì)粒21
• 2.1.2 PCR引物設(shè)計(jì)與合成21
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備21-22
• 2.1.4 主要試劑22-23
• 2.1.5 主要試劑和培養(yǎng)基的配制23-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-35
• 2.2.1 煙曲霉Hsp70基因的擴(kuò)增25-27
• 2.2.2 克隆載體pMD19T- Hsp70的構(gòu)建27-30
• 2.2.3 原核表達(dá)載體pET28a- Hsp70的構(gòu)建30-31
• 2.2.4 Hsp70的誘導(dǎo)表達(dá)31
• 2.2.5 溶解包涵體31-32
• 2.2.6 純化表達(dá)蛋白32-33
• 2.2.7 純化蛋白定性定量分析33-35
• 2.3 結(jié)果與分析35-42
• 2.3.1 煙曲霉Hsp70基因的擴(kuò)增35
• 2.3.2 鑒定pMD19T- Hsp70陽(yáng)性克隆35-38
• 2.3.3 重組質(zhì)粒pET28a- Hsp70的鑒定38-40
• 2.3.4 Hsp70的表達(dá)40-42
• 2.4 討論42-44
• 第三章 煙曲霉Hyp1基因的克隆表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化44-51
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料44
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法44-45
• 3.3 結(jié)果45-50
• 3.3.1 煙曲霉Hyp1基因的擴(kuò)增45-46
• 3.3.2 鑒定pMD19T- Hyp1陽(yáng)性克隆46-47
• 3.3.3 重組質(zhì)粒pET28a- Hyp1的鑒定47-48
• 3.3.4 Hyp1的表達(dá)48-49
• 3.3.5 Western-blot分析目的蛋白49
• 3.3.6 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化49-50
• 3.4 討論50-51
• 第四章 討論51-53
• 第五章 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-62
• 作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間所取得的科研成果62-63
• 致謝63

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