發(fā)布時間：2020-10-22 23:04

　　 背景調節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)是一類具有顯著免疫調節(jié)功能的CD4+T細胞亞群,通過抑制樹突狀細胞(DC)、T細胞等免疫細胞的功能活性在膿毒癥免疫紊亂中發(fā)揮關鍵調節(jié)作用。內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是在多種生理或病理條件下引起內質網(ER)腔內未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白聚集,導致ER功能受損的狀態(tài)。研究發(fā)現膿毒癥可誘發(fā)機體發(fā)生ERS反應,通過調控多種免疫細胞功能,在免疫炎癥反應中發(fā)揮重要作用。盡管目前已經明確Treg在膿毒癥免疫紊亂中發(fā)揮關鍵作用,ERS是否影響Treg細胞的功能及機制,目前尚未見研究報道。目的采用ERS特異性誘導劑毒胡蘿卜素(thapsigargin,TG)刺激正常及內毒素(LPS)體外模擬膿毒癥刺激條件下的小鼠脾臟Treg細胞,旨在探討ERS對Treg細胞功能的影響及其機制。方法1、免疫磁珠法分離正常BALB/C小鼠脾臟Treg細胞及CD4+T細胞,流式細胞術鑒定Treg細胞純度。依TG(0.1μmol/L)刺激的時間不同分為0、6、12、24h組,依TG刺激的濃度不同設為0、0.05、0.1、0.2μmol/L組,刺激12h后,流式細胞術檢測Treg Foxp3及CTLA-4表達的時間/劑量效應關系,確定最佳實驗濃度及時間。2、給予TG刺激后,分別采用共聚焦顯微鏡檢測內質網形態(tài)、蛋白印跡分析(Western blot)檢測PERK信號通路GRP78、PERK、eIF2α、ATF4的表達變化,評價TG誘導Treg ERS的狀態(tài),分別采用流式細胞術、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、CFSE示蹤染料標記法檢測Treg的Foxp3及CTLA-4表達、細胞因子分泌、Th1/Th2分化及對Teff的增殖抑制反應,評價Treg的功能狀態(tài),并結合PERK信號通路抑制劑(GSK2656157),分析阻斷PERK信號通路后,Treg的功能變化,探討ERS調節(jié)Treg功能的分子機制。3、給予LPS模擬體外膿毒癥刺激,應用TG后,應用上述實驗方法檢測Treg細胞內GRP78、PERK、eIF2α、ATF4的表達、Foxp3 CTLA-4的表達、細胞因子分泌、Th1/Th2分化及對Teff的增殖抑制反應以及應用GSK2656157對Treg功能活性的影響,分析體外膿毒癥狀態(tài)下,ERS對Treg功能狀態(tài)的影響和可能作用靶點。結果1、采用免疫磁珠分選得到Treg和Teff的純度分別為91%、88.2%,符合后續(xù)實驗要求;檢測Foxp3及CTLA-4的表達的時效量效關系,結果表明,TG0.1μmol/L作用12h,Foxp3的表達變化最為顯著,故選擇TG0.1μmol/L、12h用于后續(xù)實驗。同時,本研究顯示上述作用濃度及時間,Treg CTLA-4的表達均無明顯變化。2、給予TG刺激后,激光共聚焦顯微鏡檢測Treg內質網形態(tài)發(fā)生改變,內質網碎裂、膨脹、并偏向核一側聚集;GRP78、PERK、ATF4及eIF2α的磷酸化水平顯著上調,同時Treg Foxp3表達,IL-10和TGF-β的分泌均明顯增加,與Treg共培養(yǎng)的Teff增殖活性受到明顯抑制,培養(yǎng)上清中IL-4/IFN-γ比值明顯升高,IL-2生成下降(P0.05),而給予阻斷劑GSK2656157后Treg Foxp3表達,IL-10和TGF-β的分泌均明顯降低,與Treg共培養(yǎng)的Teff增殖活性抑制情況減弱,共培養(yǎng)上清中IL-4/IFN-γ比值降低,IL-2生成增加(P0.05)。3、LPS刺激Treg模擬體外膿毒癥狀態(tài)下,給予TG刺激后,GRP78、PERK、ATF4及eIF2α的磷酸化水平顯著上調,同時Treg Foxp3表達,IL-10和TGF-β的分泌均明顯增加(P0.05),與Treg共培養(yǎng)的Teff增殖活性受到明顯抑制,培養(yǎng)上清中IL-4/IFN-γ比值明顯升高,IL-2生成下降(P0.05),提示TG在LPS協(xié)同作用下進一步增強Treg免疫抑制活性;而給予阻斷劑GSK2656157后檢測到GRP78、PERK、ATF4及eIF2α的磷酸化水平顯著下降,Treg Foxp3表達,IL-10和TGF-β的分泌均明顯降低(P0.05),與Treg共培養(yǎng),Teff的增殖活性抑制情況減弱,培養(yǎng)上清中IL-4/IFN-γ比值降低,IL-2生成增加(P0.05)。結論ERS是細胞應對內外環(huán)境刺激下的一種保護性機制,研究表明ERS對免疫細胞的功能狀態(tài)具有重要調節(jié)效應。本研究結果顯示:1、給予ERS誘導劑TG刺激后,內質網形態(tài)發(fā)生改變,內質網碎裂、膨脹、并偏向核一側聚集;GRP78、PERK、ATF4及eIF2α的磷酸化水平顯著上調,提示TG誘導ERS反應發(fā)生,Treg Foxp3表達,IL-10和TGF-β的分泌均明顯增加,Teff的增殖活性受到明顯抑制,培養(yǎng)上清中IL-4/IFN-γ比值明顯升高,IL-2生成下降,提示TG誘導的ERS可明顯增強Treg的功能活性,而應用PERK抑制劑后,Treg的功能活性顯著降低,提示PERK信號途徑是影響Treg功能的可能作用靶點。2、LPS刺激Treg模擬體外膿毒癥條件下,給予TG刺激,活化PERK信號通路誘導ERS反應的同時,進一步增強Treg的功能活性,而給予PERK抑制劑后,通過阻斷PERK信號通路上分子的表達,下調Treg功能。提示ERS可能通過PERK信號通路調節(jié)Treg的免疫活性參與膿毒癥免疫紊亂的發(fā)生發(fā)展,而阻斷Treg PERK信號通路可能為膿毒癥免疫紊亂的治療提供潛在作用靶點。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

津醫(yī)科大學碩士學位論文 一、毒胡蘿卜素誘導的 ERS 對調節(jié)性 T 細胞免疫功能的將之前實驗收集的細胞培養(yǎng)上清從-20℃冰箱取出，室溫溶解，采用 ILF-β、IL-4、IFN-γ、IL-2 ELISA 檢測試劑盒檢測相應細胞因子的分泌情況（操作方法嚴格按照各 ELISA 試劑盒操作說明進行），盡量減少人為誤差。.9 統(tǒng)計學處理采用 SPSS19.0 統(tǒng)計分析軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析，計量資料結果以!未找到引用源。±s 表示，單因素多組數據方差分析對組間差異進行比較結果之間比較采用成組 t 檢驗，當 P<0.05 時，差異被認為具有統(tǒng)計學意義2 結果.1 小鼠脾臟Treg分選純度及細胞活性檢測如圖 1.1 所示，小鼠脾臟單個核細胞經過兩次 MACS 分選后，得到 CD4的純度為 88.2%，Treg 純度為 91%，臺盼藍染色檢測細胞活性大于 95%。

與對照組相比較：*P<0.051.2 流式檢測 TG 刺激對 Treg Foxp3 及 CTLA-4 表達的時間-劑量效應關系 TG刺激對內質網形態(tài)變化的影響如圖 1.3 所示：與正常對照組比較，TG 刺激可誘導 Treg 細胞內質網形態(tài)，內質網聚集、膨脹、碎裂，并偏向核一側聚集，內質網形態(tài)發(fā)生明顯適變化。提示 TG 0.1μM 刺激 12h 可顯著誘導 Treg 細胞發(fā)生應激性改變。

組相比較：*P<0.05式檢測 TG 刺激對 Treg Foxp3 及 CTLA-4 表達的時間-劑量效激對內質網形態(tài)變化的影響.3 所示：與正常對照組比較，TG 刺激可誘導 Treg 細胞內質網聚集、膨脹、碎裂，并偏向核一側聚集，內質網形態(tài)發(fā)生提示 TG 0.1μM 刺激 12h 可顯著誘導 Treg 細胞發(fā)生應激性改
【參考文獻】

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本文編號：2852202