目的:mTOR(mechanistic target of Rapamycin)是一類在真核生物中高度保守的非典型絲氨酸/蘇氨酸激酶,細胞內(nèi)主要存在mTORC1和mTORC2兩種復合體。mTOR參與眾多細胞生物學過程。在低等生物酵母細胞中,mTOR具有調(diào)控細胞骨架的功能,但在哺乳動物細胞中它是否能夠調(diào)控細胞骨架一直存在爭議。本課題旨在探討mTORC1對細胞骨架之一的微管系統(tǒng)(microtubule)的穩(wěn)定性的影響以及雷帕霉素(Rapamycin)與微管靶點化療藥物聯(lián)用對微管系統(tǒng)的調(diào)控。方法:1.采用免疫熒光技術(shù),觀察雷帕霉素預處理組和未處理組細胞對微管解聚藥物諾考達唑的抵抗能力,從而評估微管的穩(wěn)定性。2.采用蛋白免疫印跡技術(shù),檢測經(jīng)雷帕霉素處理后,微管靶點化療藥物誘導腫瘤細胞凋亡的能力。3.采用shRNA技術(shù)和Crispr-Cas9技術(shù)構(gòu)建ATG5缺陷細胞系。4.采用免疫熒光技術(shù),觀察ATG5正常組和缺陷組細胞對諾考達唑的抵抗能力。5.采用蛋白免疫印跡技術(shù),檢測mTORC1不同活化程度下,Stathmin、KIF2A、CLIP-170等微管相關(guān)蛋白的表達變化。結(jié)果:1.在雷帕霉素預處理過的HeLa細胞中,諾考達唑解聚微管的能力相比于對照組明顯降低。2.使用雷帕霉素穩(wěn)定微管后,紫杉醇與諾考達唑誘導腫瘤細胞凋亡能力降低,而對照組依托泊苷誘導腫瘤凋亡能力并沒有降低。3.在ATG5敲低和敲除的細胞中,諾考達唑解聚細胞微管結(jié)構(gòu)的能力與對照組相比并無太大差異。結(jié)論:1.雷帕霉素能夠增強微管的穩(wěn)定性,mTORC1負性調(diào)控微管穩(wěn)定性。2.雷帕霉素穩(wěn)定微管可以抑制微管靶向化療藥物的腫瘤細胞的殺傷作用。3.雷帕霉素穩(wěn)定微管的能力與細胞自噬無關(guān)。細胞自噬的發(fā)生需要穩(wěn)定的微管,但是微管的穩(wěn)定不需要細胞自噬的參與。
【學位單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R363
【部分圖文】：

mTORC1和mTORC2的組成

圖 1.2 mTOR 信號通路[29]Figure1.2 mTOR signaling pathway..1.2 mTOR 通路與腫瘤近年來的研究表明，mTOR 在腫瘤疾病的發(fā)生和進展中扮演著重要的作用瘤細胞中比較重要的細胞活動，如轉(zhuǎn)移、增殖、分化都受到 mTOR 通路的調(diào)節(jié)大量的腫瘤中都已檢測到 mTOR 的高度活化，如胰腺癌[30]、胃癌[31]、乳腺癌[32巢癌[33]等。在許多細胞系的體外實驗和老鼠模型的體內(nèi)實驗中，致癌基因的活化或者抑癌基因的丟失促進了腫瘤的生長、血管生成和轉(zhuǎn)移[34]。眾多研究，mTORC1 的高度活化縮短了細胞周期，加速了 G1/S 期的進展，使得腫瘤細殖能力增強[35]；高度活化的 mTORC1 可以活化低氧誘導因子α(HIF-α)，促進管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的轉(zhuǎn)錄和表達，導致新生血管形成為腫瘤增加額外

ton）是一種細胞的重要的機械核生物的細胞中，細胞骨架主由微絲（micro filaments）、微）組成，這三種蛋白質(zhì)纖維擁扮演著不同的角色[54]。另一種55, 56],這種蛋白質(zhì)能夠連接細胞還能將細胞的化學能轉(zhuǎn)化為機的三種骨架蛋白之一，分布于胞骨架蛋白中，微管的形態(tài)結(jié)
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