發(fā)布時(shí)間：2020-10-21 21:24

　　 胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ESCs)以及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)是細(xì)胞治療、藥物篩選、胚胎發(fā)育機(jī)制研究和構(gòu)建體外疾病模型的重要工具。目前關(guān)于干細(xì)胞的研究主要集中在小鼠這一動(dòng)物模型上。由于小鼠壽命短且其與人類生理功能及結(jié)構(gòu)差異較大,使得小鼠在臨床上的應(yīng)用有限。與小鼠相比,豬是很好的人類疾病模型,特別是在異種移植醫(yī)學(xué)、免疫及代謝疾病研究等相關(guān)方面。至今符合小鼠ESCs特點(diǎn)的豬ESCs系尚未成功建立,并且沒有統(tǒng)一的豬特異性多能性分子標(biāo)志用于鑒定不同狀態(tài)的豬多能性干細(xì)胞。本研究將豬類na?ve狀態(tài)的胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為primed狀態(tài),通過比較兩者之間多能性分子標(biāo)志的差異,初步確定了用于鑒定na?ve豬胚胎干細(xì)胞的特異性多能性分子標(biāo)志;對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已建系的豬primed胚胎干細(xì)胞、豬囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及豬胎兒成纖維細(xì)胞三者之間進(jìn)行micro RNA(mi RNA)表達(dá)譜的分析比較,構(gòu)建特定mi RNA表達(dá)載體,研究其對(duì)豬i PSCs建系的影響。以上的研究使我們進(jìn)一步了解豬多能性相關(guān)分子標(biāo)記,并為mi RNA對(duì)豬i PSCs的影響提供了新的見解。目的獲得能鑒別豬ESCs的多能性狀態(tài)的分子標(biāo)志;研究特定mi RNA對(duì)豬i PSCs細(xì)胞系建立的影響。方法1.將本實(shí)驗(yàn)室在LIF/3i(MEF)條件下建立的豬類na?ve ESCs(以下簡稱n ESCs)正常傳代后,使用LIF/3i培養(yǎng)液培養(yǎng)兩天后,更換為FGF/Activin(STO)條件繼續(xù)培養(yǎng)2-3天;采用機(jī)械切割法,對(duì)形態(tài)扁平、呈片狀的豬primed ESCs(reversed primed ESCs,rp ESCs)進(jìn)行傳代;將rp ESCs重新在LIF/3i(MEF)條件下培養(yǎng),觀察是否能重新獲得類na?ve的狀態(tài);對(duì)第5代rp ESCs進(jìn)行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色,傳代至第10代時(shí)對(duì)rp ESCs進(jìn)行核型鑒定;通過RT-PCR檢測(cè)不同狀態(tài)的豬ESCs表達(dá)FGF/Activin及LIF/STAT3信號(hào)通路相關(guān)基因的情況;類胚體形成實(shí)驗(yàn)、三胚層相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)及免疫熒光染色鑒定rp ESCs的體外分化潛能;熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative Real-time PCR,QPCR)檢測(cè)細(xì)胞譜系及多能性相關(guān)因子在轉(zhuǎn)化過程中的表達(dá)改變;利用Western blot及免疫熒光染色進(jìn)一步檢測(cè)n ESCs和rp ESCs中OCT4,LIN-28,CDX2,SOX17,c-MYC,NANOG,KLF4,Nr0B1,TBX3在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)情況。2.對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已建系的豬primed胚胎干細(xì)胞、豬囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM)及豬胎兒成纖維細(xì)胞(porcine embryonic fibroblast,PEF)三者之間進(jìn)行mi RNA表達(dá)譜的分析比較,篩選出在豬內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞中高表達(dá)的mi RNA-205。通過PCR擴(kuò)增mi RNA-205前體序列,并將其克隆于基礎(chǔ)表達(dá)載體p CAGDNA3-h Fat1,構(gòu)建過表達(dá)載體p CAG-mi R205。用脂質(zhì)體將該載體轉(zhuǎn)染到經(jīng)基因修飾的豬胎兒成纖維細(xì)胞中(含有鼠源干細(xì)胞多能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)。經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)建立豬i PSCs,利用實(shí)時(shí)QPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)的mi RNA-205的表達(dá)情況,比較分析mi RNA-205對(duì)豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的建系效率的影響。結(jié)果1.nESCs可在FGF/Activin(STO)條件下轉(zhuǎn)化為rp ESCs。當(dāng)rp ESCs重新在LIF/3i(MEF)條件下培養(yǎng)時(shí),可重新獲得類na?ve的狀態(tài)的細(xì)胞,我們將其稱為轉(zhuǎn)化得到的na?ve ESCs(reversed na?ve ESCs,rn ESCs);rp ESCs的核型正常(38XX),AP染色呈陽性,表明rp ESCs具有自我更新能力;類胚體分化實(shí)驗(yàn)顯示rp ESCs表達(dá)三胚層相關(guān)基因,具有體外分化能力;RT-PCR分析信號(hào)通路,結(jié)果顯示primed胚胎干細(xì)胞依賴于FGF/Activin信號(hào)通路,雖然rp ESCs表達(dá)LIF/STAT3信號(hào)通路的相關(guān)因子,但Western-blot檢測(cè)STAT3磷酸化結(jié)果顯示,第6代的rp ESCs幾乎不表達(dá)磷酸化的SATA3,說明rp ESCs不再依賴于LIF/STAT3信號(hào)通路;而n ESCs則明顯依賴于LIF/STAT3信號(hào)通路。QPCR檢測(cè)兩種狀態(tài)細(xì)胞之間多能性因子的表達(dá)差異表明,CDX2,SOX17,EOMES,FGF5,FOXA,PITX2在n ESCs中很少表達(dá)甚至不表達(dá),而primed細(xì)胞中這些基因呈較高表達(dá)水平;LIN28,OCT4,SOX2,NOG,DPPA5,Nr0B1,KLF4在primed細(xì)胞中表達(dá)下降;NANOG,TBX3,c-MYC在primed細(xì)胞中表達(dá)上升;通過Western-blot和免疫熒光染色進(jìn)一步在蛋白水平上檢測(cè)兩種狀態(tài)下細(xì)胞中CDX2,SOX17,OCT4,NANOG,c-MYC,KLF4,Nr0B1,LIN28,TBX3的表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)與QPCR所得結(jié)果一致。2.成功構(gòu)建了p CAG-mi R205過表達(dá)載體;相較于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞,轉(zhuǎn)染該載體的細(xì)胞mi RNA-205表達(dá)量顯著升高(P0.01);利用干細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后的i PSCs克隆長出率高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組。結(jié)論1.本實(shí)驗(yàn)室建系的豬類naive ESCs可實(shí)現(xiàn)與primed狀態(tài)細(xì)胞的互相轉(zhuǎn)化,且n ESCs依賴于LIF/STAT3信號(hào)通路而rp ESCs依賴于FGF/Activin信號(hào)通路;2.通過比較兩種狀態(tài)細(xì)胞之間多能性分子標(biāo)志的表達(dá)差異,我們初步確定了幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)記來區(qū)分primed和na?ve這兩種狀態(tài)。細(xì)胞譜系相關(guān)基因如CDX2,SOX17,EOMES,FOXA2,以及多能性基因FGF5和PITX的表達(dá)可鑒定豬ESCs的primed狀態(tài);傳統(tǒng)的小鼠ESCs的na?ve標(biāo)記物(TBX3,Nanog和c-MYC)也可作為豬ESCs的primed狀態(tài)的分子標(biāo)志。此外,多能性基因(Lin28,Oct4,SOX2,NOG,DPPA5,Nr0B1,KLF4)可以作為豬ESCs的na?ve狀態(tài)的分子標(biāo)志。3.已構(gòu)建的mi RNA-205過表達(dá)載體將有助于在后續(xù)研究中建立穩(wěn)定表達(dá)mi RNA205的細(xì)胞系,為進(jìn)一步深入研究mi RNA205在干細(xì)胞重編程和多能性維持中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

29圖 1.（A）nESCs 和 rpESCs 的形態(tài)。Scale bars=250 um （B）nESCs 和 rpESCs 克隆的堿性磷酸酶染色。 Scale bars=100 um （C）用 LIF / 2i 條件下（豬 na veESCs 培養(yǎng)液）將酶消化后的 rpESCs 接種于 MEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng) 4 天，轉(zhuǎn)化為 rnESCs。 Scale bars=250 um（D）第 10 代 rpESCs 的核型分析結(jié)果顯示，超過 72％的細(xì)胞顯示 38 條染色體的正常豬核型。（E）RT-PCR 檢測(cè)第 22 代 nESCs 、第 3 和第 6 代 rpESCs、第 3 代 rnPESCs 中信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)情況(LIF，LIFRα， LIFRβ， STAT3，gp130b，F(xiàn)GF， FGFR1，F(xiàn)GFR2， Activin-A and Nodal)。（F）第 22 代 nESCs 、第 3 和第 6 代 rpESCs 及 PEF 中的 STAT3 的磷酸化狀態(tài)，其中以 PEF 作為陰性對(duì)照。

31圖 2.（A）對(duì)第 12 代的 rpESCs 進(jìn)行懸滴培養(yǎng) 7 天，體外分化形成類胚體，。Scale bars=100 um （B）EB 在明膠預(yù)處理的培養(yǎng)皿上貼壁培養(yǎng)，可見分化細(xì)胞向周邊擴(kuò)展。Scale bars=100 um（C）在 EB 中檢測(cè)到 NCSIN（內(nèi)胚層），OSTEONECTIN（中胚層）和 NEUROD（外胚層）的表達(dá)。水作為陰性對(duì)照。 （D）對(duì) rpESCs 來源的分化細(xì)胞進(jìn)行 Keratin （內(nèi)胚層）， Desmin（中胚層）和 Neurofilament （外胚層）進(jìn)行免疫熒光染色。PI 用于細(xì)胞核染色。Scale bars=50 um。

南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文顯著的下降趨勢(shì)（圖 4A，4C 和圖 5）。KLF4，ESRRB，PRR13 和 PECAM-1在轉(zhuǎn)化過程中表現(xiàn)為波動(dòng)性表達(dá)（圖 4B）。由于 nESCs 克隆形態(tài)與小鼠 ESCs 相似，而 rpESCs 在形態(tài)上接近人ESCs[40]。因此，我們假定 nESCs 的多能性因子表達(dá)作為豬 na ve ESCs 的分子特征。對(duì)于小鼠 ESCs 來說，MYC，TBX3 和 NANOG 是調(diào)控多能性的核心轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于維持 na ve 狀態(tài) ESCs 的自我更新至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)中 QPCR 結(jié)果顯示，MYC，TBX3 和 NANOG 在 rpESCs 中表達(dá)顯著上調(diào)，而在 nESCs 中幾乎檢測(cè)不到（圖 6A）。蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果（圖 6B 和圖 6C）。
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