目的:明確病原相關(guān)分子模式(PAMPs)對(duì)人表皮細(xì)胞增殖與分化的影響。方法:在人皮膚和永生化SZ95皮脂腺細(xì)胞體外共培養(yǎng)的3D皮膚皮脂腺培養(yǎng)模型中加入不同濃度(2、20、200μg/mL)的PAMPs,包括脂多糖(LPS),磷壁酸(LTA)和肽聚糖(PGN),培養(yǎng)7天后,使用PhotoShop軟件計(jì)算表皮面積;免疫組化觀察Ki67,cytokeratin 10(CK10)的表達(dá),采用ImageJ軟件計(jì)算染色面積,Image-Pro Plus軟件計(jì)算每張圖片的累積光密度(IOD)。結(jié)果:在不同濃度的PAMPs(LPS, LTA, PGN)作用下,表皮厚度總體較對(duì)照組呈現(xiàn)劑量依賴性增加;此外,表皮基底層及角質(zhì)層細(xì)胞Ki67及CK10的表達(dá)也呈現(xiàn)不同程度的增加。結(jié)論:PAMPs具有體外促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖與分化的作用,皮膚正常微生物可能在維護(hù)皮膚屏障功能上具有重要的生物學(xué)作用。
【部分圖文】：

2 μg/mL、20 μg/mL、200 μg/mL的磷壁酸,脂多糖,肽聚糖對(duì)表皮增厚的影響 (HE,×400)

為確認(rèn)PAMPs對(duì)表皮細(xì)胞增殖和分化的影響,我們對(duì)組織進(jìn)行增殖指標(biāo)Ki67 和分化指標(biāo)CK10免疫組化染色,并使用ImageJ軟件分析染色面積,Image-Pro Plus軟件分析累積光密度(IOD)。結(jié)果見(jiàn)圖3。在濃度為2、20、200 μg/mL的LTA, LPS,PGN刺激下,表皮基底層及角質(zhì)層Ki67及CK10的表達(dá)增加。LTA在20 μg/mL濃度時(shí)Ki67的染色面積(75.67±3.288 μm2)和IOD(17.01±0.7255)均最大,結(jié)果與2 μg/mL (染色面積:52.7±2.591 μm2;IOD:11.74±0.4534)時(shí)有顯著差異(P<0.01),與200 μg/mL(染色面積:67.2±2.935 μm2;IOD:15.77±1.463)無(wú)明顯差別;LPS和PGN均在200 μg/mL時(shí)染色面積和IOD值最大,結(jié)果相較于其他兩個(gè)濃度有明顯差異(P<0.01)。LTA在200 μg/mL濃度下CK10的染色面積(10.13±0.3602 μm2)最大,在2 μg /mL時(shí)IOD(119±1.174)最大,數(shù)據(jù)相較于其他兩個(gè)濃度有顯著差異(P<0.01);LPS在20 μg /mL濃度時(shí)染色面積(3.933±0.087 μm2)和IOD(55.31±5.844)均最大,染色面積數(shù)值較2 μg/mL(1.074±0.097 μm2)有顯著差異(P<0.01),但與200 μg/mL(3.824±0.1047 μm2)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PGN在20 μg/mL時(shí)染色面積和IOD值均最大,與其他兩個(gè)濃度比較,均有明顯差異(P<0.01)。圖2 2 μg/mL、20 μg/mL、200 μg/mL的磷壁酸,脂多糖,肽聚糖對(duì)表皮增厚的影響 (HE,×400)

我們?cè)谠撃Ｐ蜕线M(jìn)一步探索微生物對(duì)表皮增殖與分化的作用。結(jié)果表明,三種PAMPs在0～200 μg/mL范圍內(nèi)劑量依賴性地促進(jìn)表皮增殖。其中,LTA和LPS在200 μg/mL濃度時(shí)表皮增厚最大,而PGN在20 μg/mL即達(dá)到最高值,我們推測(cè),革蘭氏陽(yáng)性菌的胞壁成分對(duì)促進(jìn)表皮細(xì)胞分化可能具有更加明顯的作用。PGN是革蘭氏陽(yáng)性菌如包括丙酸桿菌細(xì)胞壁的重要組成部分,在一項(xiàng)通過(guò)膠帶粘貼剝離的表皮屏障損傷模型中,在皮膚去除角質(zhì)層后的起始階段觀察到了丙酸桿菌的相對(duì)增加[19],我們推測(cè),相對(duì)于其他皮膚微生物,丙酸桿菌在皮膚修復(fù)方面可能具有更加即時(shí)的反應(yīng)[12]。此外,LTA和LPS在較低濃度時(shí)即可對(duì)表皮細(xì)胞產(chǎn)生明顯的促分化作用,但兩者的表皮增厚最明顯在200 μg/mL濃度,可能LTA和LPS在較低濃度時(shí)促進(jìn)表皮細(xì)胞的分化,但只有在高濃度時(shí)才可以最大程度地促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖,說(shuō)明微生物濃度的變化影響了表皮增殖和分化。PGN在20 μg/mL濃度時(shí)表皮增殖及促分化作用均達(dá)到最大,這可能是痤瘡丙酸桿菌定殖與增殖的變化在皮膚疾病中具有明顯作用的原因之一。人皮膚微生物的種類和數(shù)量會(huì)隨著年齡性別的不同而產(chǎn)生差異。新生兒皮膚的微生物是獲得性的,根據(jù)生產(chǎn)的方式可以從母體獲得一定的微生物[21],到青春期時(shí),由于激素水平的刺激,皮膚微生物的菌群結(jié)構(gòu)和分布會(huì)發(fā)生很大的改變,例如,促進(jìn)皮脂分泌的痤瘡丙酸桿菌就會(huì)占主導(dǎo)作用[22,23]。另外,由于年齡性別以及與疾病易感性的個(gè)體差異,不同年齡段會(huì)發(fā)生不同,最常見(jiàn)的就是青春期痤瘡的高發(fā)率[24];特應(yīng)性皮炎常常起病于兒童或青春期前,并可能持續(xù)終生[25]。這表明微生物的種類和量的變化可以對(duì)人皮膚生理產(chǎn)生不同的影響,一旦微生物的種類或者微生物的量發(fā)生了實(shí)質(zhì)性改變,就有可能會(huì)造成病理變化。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明了微生物可以促進(jìn)表皮增厚,這可能是微生物對(duì)表皮細(xì)胞增殖和分化影響的結(jié)果。
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本文編號(hào)：2848400