目的:在哺乳動(dòng)物睪丸中,支持細(xì)胞(Sertoli cell,SC)對(duì)生殖細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要,SC的最終數(shù)目決定精子的產(chǎn)生能力。SC增殖僅發(fā)生在胎兒和青春期前期,主要由卵泡刺激素和旁分泌因子調(diào)節(jié),在此期間的未成熟SC可能成為影響睪丸發(fā)育的致病性因素的重要靶點(diǎn)。TNFα(tumor necrosis factorα)在睪丸中具有多種生物學(xué)活性,參與生精細(xì)胞發(fā)育的多個(gè)過程。SC是TNFα發(fā)揮病理或生理性作用的主要靶點(diǎn)。TNFα通過識(shí)別SC上的受體參與成熟BTB(blood-testis barrier)周期性重建、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),TNFα可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的未成熟SC增殖,但缺乏其調(diào)節(jié)途徑和作用機(jī)制研究及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究試圖揭示TNFα影響未成熟SC增殖的作用機(jī)制及其對(duì)BTB成熟過程的影響。方法:1.TNFα對(duì)未成熟SC增殖的影響及泛素化PCR Array篩選差異基因。體外分離培養(yǎng)10 d齡SD鼠原代SC培養(yǎng)1-7 d,于第2 d給予不同濃度TNFα處理,于不同時(shí)間點(diǎn)分別采用(1)CCK-8、EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖率;(2)泛素化PCR Array篩選差異基因,qPCR驗(yàn)證TNFα(10 ng/ml)對(duì)Fbxo4表達(dá)影響;(3)免疫印跡檢測(cè)PCNA、Fbxo4、cyclin D1表達(dá)水平;(4)免疫共沉淀檢測(cè)Fbxo4與cyclin D1的相互作用及cyclin D1泛素化水平。2.Fbxo4過表達(dá)對(duì)TNFα促SC增殖效應(yīng)的影響。構(gòu)建含大鼠Fbxo4基因全長的腺病毒重組質(zhì)粒,包裝病毒顆粒后選取適宜MOI值于培養(yǎng)第2 d感染原代未成熟SC 24 h,于第4 d進(jìn)行TNFα處理,檢測(cè)細(xì)胞增殖率和相關(guān)蛋白表達(dá)量的改變。3.抑制NFκB活性對(duì)TNFα促SC增殖效應(yīng)的影響。免疫印跡檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路蛋白活性。體外培養(yǎng)10 d SD大鼠SC,篩選抑制NFκB通路的最佳PDTC濃度,于第2 d采用PDTC(10μM)預(yù)處理SC 2 h后加入TNFα聯(lián)合處理48h,檢測(cè)細(xì)胞增殖率和相關(guān)蛋白表達(dá)量的改變。4.體內(nèi)研究檢測(cè)TNFα對(duì)未成熟大鼠BTB功能建立的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)選取12 d未成熟的雄性SD大鼠作為研究對(duì)象。連續(xù)3 d每天腹腔注射TNFα(10μg/kg b w),對(duì)照組注射等體積的dd H_2O,于不同時(shí)間點(diǎn)(16 d、20 d、24 d、26 d、30 d、32 d、35 d)進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):(1)生物素標(biāo)記法檢測(cè)大鼠體內(nèi)BTB通透性,比較各組BTB功能成熟的時(shí)間點(diǎn);(2)免疫熒光檢測(cè)BTB連接蛋白分布;(3)免疫印跡檢測(cè)PCNA、Fbxo4、cyclin D1和連接蛋白水平。結(jié)果:1.TNFα抑制cyclin D1泛素化并促進(jìn)未成熟SC的增殖:CCK-8、EdU實(shí)驗(yàn)和PCNA表達(dá)水平變化顯示TNFα處理明顯促進(jìn)未成熟SC增殖;泛素化PCR Array篩選出5個(gè)相關(guān)差異基因(3倍);免疫印跡顯示TNFα顯著下調(diào)E3泛素連接酶Fbxo4,而其底物cyclin D1水平升高;免疫共沉淀顯示TNFα抑制了cyclin D1與Fbxo4的相互作用及其泛素化。2.Fbxo4過表達(dá)抑制TNFα對(duì)未成熟SC的促增殖作用:腺病毒Ade-Fbxo4體外感染原代未成熟SC,免疫印跡檢測(cè)Fbxo4成功過表達(dá);CCK-8和EdU試驗(yàn)表明,與Adv-Fbxo4組相比,Adv-Fbxo4+TNFα組細(xì)胞增殖無顯著變化;免疫印跡及免疫沉淀結(jié)果顯示,與Adv-Fbxo4組相比,Adv-Fbxo4+TNFα組PCNA、cyclin D1的表達(dá)水平及cyclin D1泛素化水平均無顯著變化。3.TNFα通過活化NFκB促進(jìn)未成熟SC的增殖:免疫印跡發(fā)現(xiàn)TNFα處理后p-p38/p38、p-IκBα/IκBα及p-NFκB p65/NFκB p65比值增加,說明TNFα可活化未成熟SC的p38 MAPK及NFκB通路;CCK-8及EdU試驗(yàn)均顯示NFκB抑制劑PDTC處理后,TNFα不能促進(jìn)未成熟的SC增殖(p38 MAPK抑制劑則無此效應(yīng));免疫印跡及免疫沉淀結(jié)果亦表明PDTC處理后,TNFα不再引起PCNA、Fbxo4和cyclin D1的表達(dá)水平及cyclin D1泛素化水平的明顯改變。此外,Fbxo4過表達(dá)后TNFα仍能活化NFκB。4.TNFα處理未成熟大鼠引起B(yǎng)TB成熟滯后:體內(nèi)BTB功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TNFα處理組BTB于35 dpp左右功能成熟明顯晚于對(duì)照組(24 dpp)。免疫熒光顯示TNFα處理后連接蛋白o(hù)ccludin、JAM-A在BTB的分布明顯低于相同天齡的對(duì)照組。但隨著大鼠天齡的增大,TNFα預(yù)處理引起的occludin、JAM-A的表達(dá)分布差異越來越小,并分別在26 dpp(JAM-A)和32 dpp(occludin)后恢復(fù)正常。結(jié)論:TNFα通過NFκB途徑抑制cyclin D1的泛素化降解,進(jìn)而促進(jìn)未成熟SC殖并誘導(dǎo)大鼠BTB成熟延遲。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R321.1
【部分圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果制 cyclin D1 泛素化并促進(jìn)未成熟 Sertoli 細(xì)胞的進(jìn)未成熟 Sertoli 細(xì)胞的增殖 10 dpp 未成熟 SD 鼠 Sertoli 細(xì)胞培養(yǎng) 1-7 天，于第 2g/ml TNFα 處理，于不同時(shí)間點(diǎn)（0-5 d）進(jìn)行 CCK-8 細(xì)陰性對(duì)照組相比，不同處理時(shí)間和處理濃度的 TNFα 度促進(jìn)作用（圖 3.1）。根據(jù)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn) 10、20、能顯著的促進(jìn)未成熟 SC 增殖，為達(dá)到明顯的促增殖效之后的實(shí)驗(yàn)中均采用 10 ng/ml TNFα 處理 48 h。

圖 3.2 TNFα 促進(jìn)體外培養(yǎng)未成熟大鼠 SC 增殖（A）免疫印跡檢測(cè) TNFα 對(duì) PCNA 蛋白水平的影響。（B）灰度值分析 PCNA 蛋白水平，*：與對(duì)照組相比 P<0.05，**：與對(duì)照組相比 P<0.01。（C）EdU 檢測(cè)未成熟 SC 增殖情況，紅色熒光：EdU 標(biāo)記的細(xì)胞，藍(lán)色熒光（DAPI）：細(xì)胞核，Merge：EdU 標(biāo)記圖和 DAPI 染核圖重疊圖，比例尺=50 μm。（D）統(tǒng)計(jì)分析 EdU 增殖實(shí)驗(yàn)，**：與對(duì)照組相比 P<0.013.1.2 TNFα 下調(diào) Fbxo4 并抑制 cyclin D1 的泛素化降解由于細(xì)胞周期蛋白的水平變化與泛素蛋白酶體途徑（ubiquitinproteasomesystem，UPS）密切相關(guān)，所以我們?cè)谠噲D深入探討 TNFα 促未成熟 SC 增殖機(jī)制的過程中，首先采用泛素化芯片篩選相關(guān)差異基因。于是，我們從一個(gè)含有 89 個(gè)泛素相關(guān)酶的文庫里篩選 TNFα 處理未成熟 SC 前后的差異表達(dá)基因，共篩選出 5 個(gè) mRNA 差異倍數(shù)>3 的 UPS 基因（圖 3.3、表 3.1）。通過查閱文獻(xiàn)分析，我們發(fā)現(xiàn)泛素連接酶E3 Fbxo4 可以識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞周期蛋白 cyclin D1，F(xiàn)bxo4 的減少促使 cyclin D1 泛

15圖 3.4 TNFα 抑制未成熟 Sertoli 細(xì)胞 Fbxo4 表達(dá)及 cyclin D1 泛素化（A）qPCR 檢測(cè) TNFα 處理后 Fbxo4 和 cyclin D1 的 mRNA 表達(dá)水平變化，*：與對(duì)照組相比P<0.05，**：與對(duì)照組相比 P<0.01。（B）免疫印跡檢測(cè) TNFα 處理后 Fbxo4 和 cyclin D1 的蛋白表達(dá)水平變化。（C）灰度值分析 Fbxo4 和 cyclin D1 蛋白水平，*：P<0.05，**：P<0.01。（D）免疫共沉淀檢測(cè) Fbxo4 和 cyclin D1 的相互作用以及 cyclin D1 的泛素化水平（E）灰度
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 丁思進(jìn);喬佩環(huán);張林媛;常兵;;17β-雌二醇通過HPGA和ERα干擾睪酮合成調(diào)控精子發(fā)生[J];衛(wèi)生研究;2013年03期

2 陳麗;趙巖;張?zhí)N暉;;嚙齒類動(dòng)物睪丸Leydig干細(xì)胞系研究進(jìn)展[J];衛(wèi)生研究;2012年01期

本文編號(hào)：2847762