目的:在哺乳動物睪丸中,支持細胞(Sertoli cell,SC)對生殖細胞的發(fā)育至關重要,SC的最終數(shù)目決定精子的產(chǎn)生能力。SC增殖僅發(fā)生在胎兒和青春期前期,主要由卵泡刺激素和旁分泌因子調節(jié),在此期間的未成熟SC可能成為影響睪丸發(fā)育的致病性因素的重要靶點。TNFα(tumor necrosis factorα)在睪丸中具有多種生物學活性,參與生精細胞發(fā)育的多個過程。SC是TNFα發(fā)揮病理或生理性作用的主要靶點。TNFα通過識別SC上的受體參與成熟BTB(blood-testis barrier)周期性重建、細胞凋亡和炎癥反應。研究發(fā)現(xiàn),TNFα可誘導體外培養(yǎng)的未成熟SC增殖,但缺乏其調節(jié)途徑和作用機制研究及體內實驗驗證。本研究試圖揭示TNFα影響未成熟SC增殖的作用機制及其對BTB成熟過程的影響。方法:1.TNFα對未成熟SC增殖的影響及泛素化PCR Array篩選差異基因。體外分離培養(yǎng)10 d齡SD鼠原代SC培養(yǎng)1-7 d,于第2 d給予不同濃度TNFα處理,于不同時間點分別采用(1)CCK-8、EdU檢測細胞增殖率;(2)泛素化PCR Array篩選差異基因,qPCR驗證TNFα(10 ng/ml)對Fbxo4表達影響;(3)免疫印跡檢測PCNA、Fbxo4、cyclin D1表達水平;(4)免疫共沉淀檢測Fbxo4與cyclin D1的相互作用及cyclin D1泛素化水平。2.Fbxo4過表達對TNFα促SC增殖效應的影響。構建含大鼠Fbxo4基因全長的腺病毒重組質粒,包裝病毒顆粒后選取適宜MOI值于培養(yǎng)第2 d感染原代未成熟SC 24 h,于第4 d進行TNFα處理,檢測細胞增殖率和相關蛋白表達量的改變。3.抑制NFκB活性對TNFα促SC增殖效應的影響。免疫印跡檢測相關信號通路蛋白活性。體外培養(yǎng)10 d SD大鼠SC,篩選抑制NFκB通路的最佳PDTC濃度,于第2 d采用PDTC(10μM)預處理SC 2 h后加入TNFα聯(lián)合處理48h,檢測細胞增殖率和相關蛋白表達量的改變。4.體內研究檢測TNFα對未成熟大鼠BTB功能建立的影響。體內實驗選取12 d未成熟的雄性SD大鼠作為研究對象。連續(xù)3 d每天腹腔注射TNFα(10μg/kg b w),對照組注射等體積的dd H_2O,于不同時間點(16 d、20 d、24 d、26 d、30 d、32 d、35 d)進行如下實驗:(1)生物素標記法檢測大鼠體內BTB通透性,比較各組BTB功能成熟的時間點;(2)免疫熒光檢測BTB連接蛋白分布;(3)免疫印跡檢測PCNA、Fbxo4、cyclin D1和連接蛋白水平。結果:1.TNFα抑制cyclin D1泛素化并促進未成熟SC的增殖:CCK-8、EdU實驗和PCNA表達水平變化顯示TNFα處理明顯促進未成熟SC增殖;泛素化PCR Array篩選出5個相關差異基因(3倍);免疫印跡顯示TNFα顯著下調E3泛素連接酶Fbxo4,而其底物cyclin D1水平升高;免疫共沉淀顯示TNFα抑制了cyclin D1與Fbxo4的相互作用及其泛素化。2.Fbxo4過表達抑制TNFα對未成熟SC的促增殖作用:腺病毒Ade-Fbxo4體外感染原代未成熟SC,免疫印跡檢測Fbxo4成功過表達;CCK-8和EdU試驗表明,與Adv-Fbxo4組相比,Adv-Fbxo4+TNFα組細胞增殖無顯著變化;免疫印跡及免疫沉淀結果顯示,與Adv-Fbxo4組相比,Adv-Fbxo4+TNFα組PCNA、cyclin D1的表達水平及cyclin D1泛素化水平均無顯著變化。3.TNFα通過活化NFκB促進未成熟SC的增殖:免疫印跡發(fā)現(xiàn)TNFα處理后p-p38/p38、p-IκBα/IκBα及p-NFκB p65/NFκB p65比值增加,說明TNFα可活化未成熟SC的p38 MAPK及NFκB通路;CCK-8及EdU試驗均顯示NFκB抑制劑PDTC處理后,TNFα不能促進未成熟的SC增殖(p38 MAPK抑制劑則無此效應);免疫印跡及免疫沉淀結果亦表明PDTC處理后,TNFα不再引起PCNA、Fbxo4和cyclin D1的表達水平及cyclin D1泛素化水平的明顯改變。此外,Fbxo4過表達后TNFα仍能活化NFκB。4.TNFα處理未成熟大鼠引起B(yǎng)TB成熟滯后:體內BTB功能檢測發(fā)現(xiàn)TNFα處理組BTB于35 dpp左右功能成熟明顯晚于對照組(24 dpp)。免疫熒光顯示TNFα處理后連接蛋白occludin、JAM-A在BTB的分布明顯低于相同天齡的對照組。但隨著大鼠天齡的增大,TNFα預處理引起的occludin、JAM-A的表達分布差異越來越小,并分別在26 dpp(JAM-A)和32 dpp(occludin)后恢復正常。結論:TNFα通過NFκB途徑抑制cyclin D1的泛素化降解,進而促進未成熟SC殖并誘導大鼠BTB成熟延遲。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R321.1
【部分圖文】：

中國醫(yī)科大學碩士學位論文3 實驗結果制 cyclin D1 泛素化并促進未成熟 Sertoli 細胞的進未成熟 Sertoli 細胞的增殖 10 dpp 未成熟 SD 鼠 Sertoli 細胞培養(yǎng) 1-7 天，于第 2g/ml TNFα 處理，于不同時間點（0-5 d）進行 CCK-8 細陰性對照組相比，不同處理時間和處理濃度的 TNFα 度促進作用（圖 3.1）。根據(jù)該實驗結果，發(fā)現(xiàn) 10、20、能顯著的促進未成熟 SC 增殖，為達到明顯的促增殖效之后的實驗中均采用 10 ng/ml TNFα 處理 48 h。

圖 3.2 TNFα 促進體外培養(yǎng)未成熟大鼠 SC 增殖（A）免疫印跡檢測 TNFα 對 PCNA 蛋白水平的影響。（B）灰度值分析 PCNA 蛋白水平，*：與對照組相比 P<0.05，**：與對照組相比 P<0.01。（C）EdU 檢測未成熟 SC 增殖情況，紅色熒光：EdU 標記的細胞，藍色熒光（DAPI）：細胞核，Merge：EdU 標記圖和 DAPI 染核圖重疊圖，比例尺=50 μm。（D）統(tǒng)計分析 EdU 增殖實驗，**：與對照組相比 P<0.013.1.2 TNFα 下調 Fbxo4 并抑制 cyclin D1 的泛素化降解由于細胞周期蛋白的水平變化與泛素蛋白酶體途徑（ubiquitinproteasomesystem，UPS）密切相關，所以我們在試圖深入探討 TNFα 促未成熟 SC 增殖機制的過程中，首先采用泛素化芯片篩選相關差異基因。于是，我們從一個含有 89 個泛素相關酶的文庫里篩選 TNFα 處理未成熟 SC 前后的差異表達基因，共篩選出 5 個 mRNA 差異倍數(shù)>3 的 UPS 基因（圖 3.3、表 3.1）。通過查閱文獻分析，我們發(fā)現(xiàn)泛素連接酶E3 Fbxo4 可以識別并結合細胞周期蛋白 cyclin D1，F(xiàn)bxo4 的減少促使 cyclin D1 泛

15圖 3.4 TNFα 抑制未成熟 Sertoli 細胞 Fbxo4 表達及 cyclin D1 泛素化（A）qPCR 檢測 TNFα 處理后 Fbxo4 和 cyclin D1 的 mRNA 表達水平變化，*：與對照組相比P<0.05，**：與對照組相比 P<0.01。（B）免疫印跡檢測 TNFα 處理后 Fbxo4 和 cyclin D1 的蛋白表達水平變化。（C）灰度值分析 Fbxo4 和 cyclin D1 蛋白水平，*：P<0.05，**：P<0.01。（D）免疫共沉淀檢測 Fbxo4 和 cyclin D1 的相互作用以及 cyclin D1 的泛素化水平（E）灰度
【參考文獻】

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1 丁思進;喬佩環(huán);張林媛;常兵;;17β-雌二醇通過HPGA和ERα干擾睪酮合成調控精子發(fā)生[J];衛(wèi)生研究;2013年03期

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本文編號：2847762