研究發(fā)現(xiàn),作為胞內(nèi)生命活動的主要執(zhí)行者,許多蛋白質(zhì)只有經(jīng)歷翻譯后的加工才能具有生物活性。蛋白質(zhì)的棕櫚�；堑鞍踪|(zhì)翻譯后修飾的重要方式之一。DHHC蛋白家族是最早在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)與棕櫚�；揎椬饔孟嚓P(guān)的一類蛋白,它們大多具有蛋白質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶(protein acyltransferase, PAT)活性。2004年隨著Bredt DS研究小組完成人類和小鼠基因組23種DHHC蛋白基因的克隆與鑒定,人們對于這類蛋白功能的了解也逐漸深入。目前,有關(guān)棕櫚酰化蛋白質(zhì)組學(xué)和棕櫚�；D(zhuǎn)移酶DHHC家族的遺傳學(xué)分析結(jié)果,暗示蛋白質(zhì)的棕櫚�；谏窠�(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和相關(guān)神經(jīng)疾病的病發(fā)過程中可能起到重要的調(diào)控作用。因此,闡明棕櫚�；揎椬饔迷谏窠�(jīng)系統(tǒng)中的作用及分子調(diào)控機制成為了近些年神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs)屬于多潛能干細胞,具有自我更新能力,并且在胚胎發(fā)育及成年腦中均能分化產(chǎn)生神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。NSCs的分化成熟,可以大致分為如下3個階段：1)NSCs自我更新；2)NSCs被賦予具有分化潛能的神經(jīng)前體細胞；3)退出周期,處于有絲分裂靜止期,分化形成具有特殊形態(tài)和功能的神經(jīng)細胞。其實,在NSCs分化過程中,這些細胞形態(tài)和功能的改變很大程度上是由細胞所處不同階段的特定基因表達模式所決定的。其中,主要包括多潛能因子Sox2、原神經(jīng)基因bHLH (basic Helix-Loop-Helix, bHLH)家族和細胞周期依賴激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors, CKIs)。 NSCs自我更新能力及干性維持的內(nèi)部機制主要是通過多潛能因子的表達和分化命運決定因子的沉默而實現(xiàn)的。NSCs分化命運決定的內(nèi)部機制也是通過時間和空間上高度精確的調(diào)控機制完成的,即分化命運決定因子的激活與表達以及多潛能因子的沉默。 目前,研究發(fā)現(xiàn)真核基因的表達在多個層次上受到精確的調(diào)控,而染色質(zhì)的修飾是真核基因轉(zhuǎn)錄的第一調(diào)控靶點。其中,組蛋白的共價修飾對染色質(zhì)的動態(tài)結(jié)構(gòu)具有核心調(diào)節(jié)作用,它是表觀遺傳學(xué)重要的調(diào)節(jié)方式之一。在神經(jīng)細胞命運決定過程中常常伴隨著組蛋白乙�；揎椝降母淖�。組蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase, HAT) P300在神經(jīng)系統(tǒng)中表達豐富,它參與了神經(jīng)系統(tǒng)在形式和功能上的發(fā)生、可塑性和穩(wěn)態(tài)的建立。P300通過自身的HAT活性,乙�；M蛋白賴氨酸,染色質(zhì)發(fā)生重塑,使轉(zhuǎn)錄因子易于與DNA結(jié)合,從而促進基因轉(zhuǎn)錄。其中,組蛋白H3和H4就是其乙酰化共價修飾的底物之一。 本研究中,我們通過建立視黃酸(retinoic acid, RA)誘導(dǎo)的P19細胞定向分化為神經(jīng)樣細胞的體外模型,利用棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑——小分子化合物2-bromopalmitate (2BROP),探討棕櫚�；揎椩贜SCs發(fā)育中的作用及相關(guān)表觀遺傳分子機制。 第一部分棕櫚�；揎椣嚓P(guān)蛋白在神經(jīng)干細胞發(fā)育過程中的表達 為了揭示棕櫚�；揎椬饔檬欠駞⑴cNSCs發(fā)育過程,于NSCs發(fā)育的各階段,包括P19細胞多潛能狀態(tài)、NSCs增殖和NSCs分化等三個階段,分別檢測23個棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶即DHHC家族成員的表達情況。結(jié)果顯示,在NSCs發(fā)育階段,共有20個DHHC家族成員的mRNA表達。其中,DHHC1、4、7、9、24于NSCs發(fā)育各階段的mRNA表達無明顯變化。DHHC5、13、14、16、17、20、21成員于NSCs增殖階段mRNA的表達量獲得增高,并且DHHC5、17、21在NSCs分化階段也將持續(xù)性高表達。而DHHC2、6、8、11、15、18、19、23成員的mRNA僅于NSCs分化階段高表達。 接下來,我們利用酰基-生物素交換法(Acyl-biotinyl exchange method, ABE)技術(shù),檢測NSCs增殖與分化兩階段,蛋白棕櫚�；揎椝角闆r。結(jié)果顯示,多種蛋白在NSCs增殖與分化階段被棕櫚�；揎�,并在不同的NSCs發(fā)育階段,呈現(xiàn)出一定的特異性,如NSCs增殖階段,棕櫚酰化蛋白條帶分布于～10、25、45、50、70、170kDa；而NSCs分化階段,蛋白分布于～25、55、60、70、100、125、150、290kDa。 本實驗結(jié)果顯示,大多數(shù)DHHC家族成員不同程度的表達于NSCs發(fā)育各階段,并且在不同的NSCs發(fā)育階段,棕櫚�；揎椀牡鞍壮尸F(xiàn)出一定的特異性,暗示DHHC家族成員和它們所介導(dǎo)的棕櫚�；揎梾⑴cNSCs發(fā)育過程的調(diào)控,棕櫚�；揎椏赡芡ㄟ^特異性的影響NSCs發(fā)育各階段中關(guān)鍵蛋白的生物活性,從而參與調(diào)控NSCs的命運決定。 第二部分小分子化合物2BROP對神經(jīng)干細胞增殖的作用 為了研究棕櫚�；揎棇SCs增殖的影響,我們首先利用MTT技術(shù),檢測不同劑量的2BROP對于細胞代謝活力的影響。結(jié)果顯示,與對照組(0μ M)相比,1-15μM加藥組中細胞活力表現(xiàn)出一定的增強；尤其是10uM加藥組,但是統(tǒng)計學(xué)無明顯差異。然而,與對照組相比,25μ M和50μM加藥組中,細胞活力減弱,MTT值明顯降低,并具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。與此同時,倒置相差顯微鏡,觀察神經(jīng)球的結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化。結(jié)果顯示,隨著RA誘導(dǎo)的進行,對照組中,細胞聚集體不斷增大,最終形成一個結(jié)構(gòu)致密、表面規(guī)整的細胞團。10μM終濃度加藥組組中,細胞聚集體的發(fā)生和增長過程與對照組相比,未見異常。但是,25μM加藥組中,細胞聚集體的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變,表現(xiàn)為細胞團形態(tài)不規(guī)則、內(nèi)部有空隙。 接下來,我們利用TUNEL技術(shù),在NSCs增殖階段,檢測小分子化學(xué)物2BROP對于細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,2BROP處理48h后,與對照組相比,10μM加藥組中,細胞團中TUNEL陽性細胞數(shù)沒有明顯差異；而25u M處理組中,TUNEL陽性細胞數(shù)明顯增多。隨后,我們利用、Vestern Blot和免疫熒光染色技術(shù),檢測了相關(guān)凋亡信號通路的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),25μM處理組中線粒體相關(guān)凋亡通路明顯激活。與對照組相比,25μM處理組中抗凋亡Bcl-2的表達量減少,促凋亡的Bax和活化的Caspase3的表達量增多；而10μM加藥組中Bcl-2、Bax與活化的Caspase3表達量沒有明顯變化 本實驗結(jié)果,顯示在一定的劑量范圍內(nèi),小分子化合物2BROP對于NSCs增殖過程,并沒有產(chǎn)生明顯的影響；而高濃度2BROP將會對細胞產(chǎn)生毒性,引發(fā)細胞凋亡。 第三部分小分子化合物2BROP對神經(jīng)干細胞分化的作用 為了探究蛋白棕櫚�；揎椩贜SCs分化階段中的相關(guān)作用及其分子機制,我們利用免疫熒光技術(shù)和Western Blot等技術(shù),檢測神經(jīng)分化標記物MAP2的表達與分布情況。結(jié)果顯示,與對照組相比,2BROP處理組中,MAP2陽性細胞數(shù)明顯減少,統(tǒng)計學(xué)具有顯著性差異；且神經(jīng)分化各階段,MAP2蛋白的表達均受到明顯抑制。 接下來,利用Western Blot和qRT-PCR技術(shù),我們檢測了NSCs分化命運決定相關(guān)因子的表達情況,如多潛能因子Oct4; NSCs標記物Sox2、Nestin;神經(jīng)前體細胞標記物β-tubulinⅢ和神經(jīng)分化決定因子Neurogl、NeuroD1。結(jié)果顯示,隨著NSCs命運的獲得,對照組與2BROP處理組中,Oct4的表達迅速下降直至消失,無明顯差異。與對照組相比,2BROP組中神經(jīng)前體細胞標記物β-tubulinIII、分化命運決定因子Neurog1和NeuroD1的表達于神經(jīng)分化各階段均呈現(xiàn)出明顯地降低。與此相反,2BROP處理組中,NSCs標記物Sox2與Nestin卻表現(xiàn)出一定的持續(xù)性高表達。同時,MTT實驗結(jié)果顯示,與對照組分化各階段的MTT值無明顯變化相比,2BROP處理組中,隨著分化天數(shù)的延長,MTT值呈現(xiàn)出一定的增。這些結(jié)果提示我們,在神經(jīng)分化階段,2BROP可能通過增強NSCs的干細胞特性的維持,從而阻礙神經(jīng)分化的發(fā)生。 為了驗證NSCs分化階段2BROP是否增強了細胞的增殖能力,我們首先利用BrdU摻入實驗,檢測分化階段細胞的增殖情況。結(jié)果顯示,在神經(jīng)分化的第四天,與對照組相比,2BROP處理組中,BrdU陽性細胞數(shù)明顯增多,并且統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異。然后,我們利用膜標記-FACS技術(shù)追蹤細胞增殖的變化。分化階段的細胞使用熒光染料標記。細胞每增殖一次,熒光強度便會減弱一半。結(jié)果顯示,懸浮培養(yǎng)24h后,對照組中單個細胞的熒光強度并沒有明顯的變化；而2BROP處理后,單個細胞的熒光強度發(fā)生不同程度的減弱。 為了進一步分析2BROP在NSCs分化階段對于細胞增殖和周期的影響,利用FACS技術(shù),分析分化階段細胞周期的分布。結(jié)果顯示,神經(jīng)分化第四天,對照組中細胞主要分布于G0/G1期；而2BROP處理組中,G0/G1期的細胞數(shù)量減少,S期的細胞數(shù)量明顯增多。與此同時,我們利用qRT-PCR技術(shù),檢測了與神經(jīng)分化相關(guān)的CKIs家族成員的表達情況,借以闡明2BROP阻礙周期退出的相關(guān)機制。結(jié)果顯示,與對照組相比,2BRPP處理后,分化相關(guān)的CKIs成員的表達受到不同程度的降低。其中,P57的變化最為明顯。作為對照,細胞周期增殖標記物Ki67的表達在2BROP處理組中獲得了一定的持續(xù)性高表達。 本實驗結(jié)果,顯示在NSCs分化階段,2BROP處理后,NSCs通過下調(diào)CKIs家族成員,尤其是P57的表達,從而阻礙細胞周期的退出與神經(jīng)分化的發(fā)生,使分化狀態(tài)下NSCs自我更新能力獲得明顯的提高。 第四部分小分子化合物2BROP對神經(jīng)干細胞分化表觀遺傳機制的作用 已知,神經(jīng)分化階段,介導(dǎo)細胞周期調(diào)控的P57的表達依賴于組蛋白H3、H4的乙酰化水平。為了檢測組蛋白乙酰化修飾是否參與2BROP介導(dǎo)的神經(jīng)分化,我們利用免疫熒光、Western Blot等技術(shù),檢測NSCs分化階段乙�；M蛋白H3、H4的分布與表達。結(jié)果顯示,當(dāng)細胞進入分化階段時,組蛋白H3與H4的乙�；匠尸F(xiàn)出一定的上升,但是2BROP處理組中組蛋白H3與H4的乙�；矫黠@的低于對照組的水平。為了進一步驗證組蛋白乙�；揎検欠駞⑴c2BROP介導(dǎo)的神經(jīng)分化,我們使用去組蛋白去乙�；种苿┣啪谹(Trichostatin A, TSA)預(yù)處理細胞,發(fā)現(xiàn)TSA處理后,2BROP抑制神經(jīng)分化的現(xiàn)象得到一定的恢復(fù)。值得注意的是,TSA與2BROP共處理組中,β-tubulinⅢ的表達甚至高于正常分化組。 接下來,我們免疫共沉淀、ELISA等技術(shù),檢測組蛋白H3、H4乙�；揎椕窹300乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。結(jié)果顯示,與對照組相比,2BROP處理后,P300的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性受到明顯的抑制。同時,我們利用Western Blot、免疫熒光等技術(shù),檢測了分化階段P300的表達與分布。結(jié)果顯示,雖然與對照組相比,2BROP處理組中P300的蛋白表達水平?jīng)]有明顯變化,但是P300在胞內(nèi)的分布卻發(fā)生明顯的改變。對照組中,P300主要分布于細胞核中,而2BROP處理組中P300蛋白遍布于細胞質(zhì)和細胞核中。 作為脂質(zhì)化修飾方式之一,棕櫚�；揎椬饔脜⑴c調(diào)節(jié)蛋白的胞內(nèi)分布、物質(zhì)運輸、蛋白間相互作用等過程。接下來,我們探究2BROP是否通過調(diào)節(jié)P300的棕櫚�；揎梾⑴c調(diào)控組蛋白乙酰化修飾與神經(jīng)分化。首先,我們使用CSS-Palm4.0軟件預(yù)測P300蛋白是否擁有典型的棕櫚酰化位點。結(jié)果顯示,P300蛋白擁有多個保守性較高的棕櫚�；瘽撛谛揎椢稽c。然后,我們使用ABE方法,檢測NSCs分化階段,對照組與2BROP處理組中P300的棕櫚酰化修飾水平。結(jié)果顯示,蛋白P300可以被棕櫚�；揎�,并且與對照組相比,2BROP處理組中P300的棕櫚酰化修飾水平明顯受到抑制,統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異。 本實驗結(jié)果,顯示在NSCs分化階段,棕櫚�；揎椡ㄟ^調(diào)節(jié)表觀遺傳關(guān)鍵因子P300的脂質(zhì)化修飾水平,進而影響P300的核轉(zhuǎn)位和HAT活性,最終調(diào)節(jié)組蛋白H3、H4的乙�；胶头只\相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活。 結(jié)論 神經(jīng)干細胞的分化、發(fā)育與成熟是現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)研究的熱點之一。棕櫚�；揎椬饔迷谏窠�(jīng)發(fā)育過程中的作用及分子機制尚未闡明。我們建立P19細胞定向分化為神經(jīng)樣細胞的體外模型,利用棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑——小分子化合物2BROP,探討棕櫚酰化修飾在神經(jīng)發(fā)育中的作用及分子機制。利用P19神經(jīng)定向分化模型,研究發(fā)現(xiàn),DHHC家族成員分別特異性地表達于NSCs的增殖和分化階段。并且在這些階段中,許多蛋白發(fā)生了明顯的棕櫚酰化修飾。2BROP (10μM)處理后,NSCs增殖的命運沒有發(fā)生明顯的改變。但是,在NSCs分化階段,發(fā)現(xiàn)2BROP (10μM)處理后,NSCs的神經(jīng)分化過程和細胞周期的退出受到阻斷,而NSCs的數(shù)量卻維持在一定的高水平狀態(tài)。進一步的檢測,表明細胞周期調(diào)節(jié)因子CKI家族中P57的表達明顯降低。已知,神經(jīng)分化階段,P57的表達依賴于組蛋白H3/H4的乙�；健．�(dāng)加入組蛋白去乙酰化抑制劑曲古菌素A(Trichostatin A, TSA)后,發(fā)現(xiàn)P57的表達和神經(jīng)分化得到一定程度的恢復(fù)。最終,研究表明在神經(jīng)分化階段,2BROP處理后,由于特異性的抑制P300的棕櫚酰化修飾水平,影響其核轉(zhuǎn)移,進而阻礙組蛋白H3/H4的乙�；揎椗c神經(jīng)分化。因此,本研究揭示了一個由基因表達、表觀遺傳修飾、蛋白翻譯后修飾共同參與的神經(jīng)分化命運決定調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究不僅深化了棕櫚酰化修飾在神經(jīng)發(fā)育中的作用,拓展了其分子調(diào)控機制,同時為研究棕櫚�；揎椬饔迷诮M織發(fā)育過程中的作用開辟了一個全新的領(lǐng)域、提供了一個新的視野。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R322.8
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
前言
研究意義
符號說明
第一部分 棕櫚�；揎椣嚓P(guān)蛋白在神經(jīng)干細胞發(fā)育過程中的表達
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    附圖
第二部分 小分子化合物2BROP對神經(jīng)干細胞增殖的作用
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    附圖
第三部分 小分子化合物2BROP對神經(jīng)干細胞分化的作用
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    附圖
第四部分 小分子化合物2BROP對神經(jīng)干細胞分化表觀遺傳機制的作用
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    附圖
參考文獻
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄
學(xué)位評閱及答辯情況表
綜述
    參考文獻
英文論文1
英文論文2

【共引文獻】

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本文編號：2845124