目的:模擬人類痹證成因,建立符合中醫(yī)“痹證”特點的病證結(jié)合的風(fēng)濕熱痹RA大鼠模型。通過秦艽寒熱不同配伍藥對的作用,從分子生物學(xué)角度研究秦艽及其藥對對風(fēng)濕熱痹RA大鼠的干預(yù)作用,分析寒、熱、平不同藥性配伍與風(fēng)濕熱痹病證之間的關(guān)系,探討藥性與疾病、藥性與療效之間的關(guān)聯(lián)性。方法:1.風(fēng)濕熱痹RA大鼠模型的建立80只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,采用隨機數(shù)字表法分為空白組、Ⅱ型膠原組、病證模型組(Ⅱ型膠原+風(fēng)濕熱)、陽性藥組(雷公藤多苷片組)、單味秦艽組、秦艽威靈仙組(簡稱秦威組)、秦艽桑寄生組(簡稱秦桑組)、秦艽防己組(簡稱秦防組),每組10只,共8組。實驗第1 d,除空白組外,其余各組大鼠取背部2點(背部脊柱兩側(cè))、尾根部1點,剃毛,皮下注射0.1 m L CⅡ乳劑,共0.3 m L致炎,實驗第12 d,于大鼠左后足跖皮內(nèi)注射0.1 mL CⅡ乳劑進行二次免疫,空白組在相同時間相同部位注射等量生理鹽水;從首次注射CⅡ乳劑的第2 d起,除空白組和Ⅱ型膠原組外,其余各組均使用改造后的人工氣候箱進行風(fēng)濕熱痹病證模型造模;所模擬的風(fēng)濕熱環(huán)境條件為:溫度36~38℃,風(fēng)速5 m/s,相對濕度≧95%,實驗中以37℃蒸汽熏蒸,每天一次,每次30 min(其中每間隔10分鐘換氣一次),總共造模18 d。2.給藥及一般狀態(tài)觀察造模結(jié)束后,各中藥組按25.05 g·kg~(-1),雷公藤多苷片組按6 mg·kg~(-1)灌胃給藥,空白組、Ⅱ型膠原組及病證模型組給予等量生理鹽水,每天1次,連續(xù)21 d。實驗中,對各組大鼠每3天測量一次體重和踝關(guān)節(jié)腫脹度,每天觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲食飲水、大小便、足跖顏色以及負(fù)重前行等變化情況。3.影像學(xué)檢查實驗第35 d,采用多功能活體成像儀(KODAK)對各組大鼠進行活體雙后肢X線拍片并解讀。4.組織病理學(xué)觀察實驗第40 d,處死動物,每組大鼠取2只左后肢踝關(guān)節(jié),4%多聚甲醛液固定,脫鈣,常規(guī)石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡下觀察關(guān)節(jié)組織形態(tài)變化。5.免疫組織化學(xué)法檢測大鼠踝關(guān)節(jié)病理切片常規(guī)脫水,透明后中性樹膠封片,顯微鏡觀察,以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)淡黃棕色至褐黃色顆粒狀著色者為陽性細(xì)胞,采用IPP6.0測量踝關(guān)節(jié)中VEGF、NF-κB、MMP-1、TIMP-1被染成棕黃色顆粒的積分光密度值。6.蛋白表達(dá)水平研究采用蛋白免疫印跡技術(shù)法半定量檢測各組大鼠踝關(guān)節(jié)VEGF、NF-κB、MMP-1、TIMP-1的蛋白表達(dá)量,并通過ImageJ和SPSS 21.0軟件進行條帶的灰度值處理和數(shù)據(jù)分析。7.基因表達(dá)水平研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法定量檢測各組大鼠踝關(guān)節(jié)VEGF mRNA、NF-κB mRNA、MMP-1 mRNA、TIMP-1 mRNA的基因表達(dá)量,并通過SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和處理。結(jié)果:1.一般狀態(tài)觀察整個實驗中,空白組大鼠活躍度高,精神狀態(tài)良好,毛發(fā)有光澤。造模組大鼠則在不同的階段呈現(xiàn)出不同的狀態(tài):初次免疫階段,各造模組大鼠活動較少,毛發(fā)蓬松,飲食飲水減少,左后足跖均出現(xiàn)不同程度的紅腫,但程度較輕,不影響活動;二次加強免疫后出現(xiàn)嚴(yán)重的足跖腫脹,左足拖行或抬起,不能負(fù)重,腫脹部位明顯發(fā)熱、拒按,皮膚顏色由嫩紅色到深紅色,最后變?yōu)榘导t色,觸感由柔軟到僵硬;大鼠爭斗次數(shù)增多,煩躁,具攻擊性;飲食飲水明顯減少,個別尿液呈金黃色。經(jīng)藥物治療后,各給藥組大鼠左后足跖紅腫發(fā)熱均有不同程度的消退,精神狀態(tài)好轉(zhuǎn),活躍程度增加,飲食飲水逐漸正常,而Ⅱ型膠原組、病證模型組未見明顯改善。2.影像學(xué)檢查結(jié)果空白組可見大鼠雙側(cè)踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)間隙清晰,關(guān)節(jié)面光滑,骨結(jié)構(gòu)正常,正常踝關(guān)節(jié)表現(xiàn);Ⅱ型膠原組及病證模型組大鼠可見雙側(cè)關(guān)節(jié)周圍軟組織腫脹,關(guān)節(jié)間隙狹窄,且病證模型組關(guān)節(jié)間隙狹窄明顯高于Ⅱ型膠原組,并有骨侵蝕病灶;各給藥組大鼠可見雙側(cè)關(guān)節(jié)周圍軟組織腫脹消失,關(guān)節(jié)間隙狹窄明顯改善,尤以秦防組最為明顯,但仍有骨侵蝕病灶。3.組織病理學(xué)結(jié)果空白組關(guān)節(jié)面光滑,潮線清晰,軟骨細(xì)胞排列整齊,未見炎性細(xì)胞浸潤;Ⅱ型膠原組及病證模型組關(guān)節(jié)面完全破壞,骨小梁變細(xì),髓腔變寬,大量的炎性細(xì)胞浸潤,大量的肉芽組織增生,周圍血管豐富并嚴(yán)重擴張,血管翳形成,纖維增生,且病證模型組破壞程度明顯高于Ⅱ型膠原組;各給藥組關(guān)節(jié)面雖然有不同程度破壞,但炎性細(xì)胞明顯減少,肉芽組織中血管減少,肉芽老化,纖維增多,存在大面積修復(fù)創(chuàng)傷的瘢痕組織,其中尤以秦防組關(guān)節(jié)面修復(fù)較好。4.VEGF表達(dá)結(jié)果與空白組比較,Ⅱ型膠原組和病證模型組大鼠踝關(guān)節(jié)VEGF的積分光密度值、蛋白相對表達(dá)量和基因表達(dá)水平均有不同程度的升高,其中病證模型組明顯高于Ⅱ型膠原組(P0.01);與病證模型組比較,各給藥組VEGF的積分光密度值、蛋白相對表達(dá)量和基因表達(dá)水平均有不同程度的降低,其中秦防組明顯低于其他給藥組(P0.01)。5.NF-κB表達(dá)結(jié)果與空白組比較,Ⅱ型膠原組和病證模型組大鼠踝關(guān)節(jié)NF-κB的積分光密度值、蛋白相對表達(dá)量和基因表達(dá)水平均有不同程度的升高,其中病證模型組高于Ⅱ型膠原組(P0.05);與病證模型組比較,各給藥組NF-κB的積分光密度值、蛋白相對表達(dá)量和基因表達(dá)水平均有不同程度的降低(P0.01);各給藥組之間比較,秦防組NF-κB的積分光密度值、蛋白相對表達(dá)量降低最為明顯(P0.05),而基因表達(dá)水平差異不明顯(P0.05)。6.MMP-1和TIMP-1表達(dá)結(jié)果與空白組比較,Ⅱ型膠原組和病證模型組大鼠踝關(guān)節(jié)MMP-1蛋白相對表達(dá)量和基因表達(dá)水平均有不同程度的升高,TIMP-1降低,其中病證模型組MMP-1明顯高于Ⅱ型膠原組(P0.05),TIMP-1低于Ⅱ型膠原組(P0.05);與病證模型組比較,各給藥組MMP-1蛋白相對表達(dá)量和基因表達(dá)水平均有不同程度的降低(P0.05),TIMP-1有不同程度的升高(P0.05),其中秦防組MMP-1蛋白相對表達(dá)量明顯低于其他給藥組(P0.05),TIMP-1高于其他給藥組(P0.05),而MMP-1基因表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異(P0.05),TIMP-1基因表達(dá)水平明顯高于其他給藥組(P0.05)。結(jié)論:本研究基于秦艽寒熱不同配伍藥對對風(fēng)濕熱痹RA的作用,通過影像學(xué)及組織病理學(xué)觀察、免疫組織化學(xué)法檢測、蛋白表達(dá)水平、基因表達(dá)水平等研究,結(jié)果表明:1.在風(fēng)濕熱痹RA大鼠踝關(guān)節(jié)組織中VEGF、NF-κB、MMP-1蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平的增高與炎癥程度呈正相關(guān)性,而TIMP-1蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)與炎癥程度呈負(fù)相關(guān)性。病證模型組大鼠VEGF、NF-κB、MMP-1表達(dá)升高、TIMP-1表達(dá)降低,提示關(guān)鍵分子的正常動態(tài)平衡表達(dá)被打破,體內(nèi)的分子調(diào)節(jié)機制發(fā)生變化,從而加重病情。2.秦艽寒熱不同配伍藥對治療風(fēng)濕熱痹RA的作用機制可能與其降低VEGF、NF-κB、MMP-1表達(dá),升高TIMP-1表達(dá),減少炎性細(xì)胞浸潤,減少血管翳形成,降低關(guān)節(jié)軟骨破壞有關(guān)。3.對風(fēng)濕熱痹RA大鼠的治療,秦防組(平寒相配)能夠顯著降低VEGF、NF-κB、MMP-1蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平,升高TIMP-1蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平,從而減輕炎癥程度,緩解軟骨損傷,其效果優(yōu)于其他治療組,充分體現(xiàn)了中醫(yī)“熱者寒之”“療熱以寒藥”的用藥原則。
【學(xué)位單位】：甘肅中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R285.5;R-332
【部分圖文】：

第二次加強免疫后大鼠一般狀況

17單味秦艽組 秦威組 秦桑組 秦防組圖 1（b） 經(jīng)藥物治療后各組大鼠足跖腫脹度觀察Figure 1（b）After treatment with drugs,the general state of rat foot plantar in each group3.2 風(fēng)濕熱痹 RA 大鼠影像學(xué)結(jié)果結(jié)果如圖 2 所示，空白組：可見模型大鼠雙側(cè)踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)間隙清晰，關(guān)節(jié)面光滑，骨結(jié)構(gòu)正常，正常踝關(guān)節(jié)表現(xiàn)。Ⅱ型膠原組：可見模型大鼠雙側(cè)關(guān)節(jié)周圍

陽性藥組：見模型大鼠雙側(cè)關(guān)節(jié)周圍軟組織腫脹明顯消失，與空白對照組相比，關(guān)節(jié)間隙狹窄有所改善，但改善不顯著，骨侵蝕病灶仍清晰可見。秦防組：見模型大鼠雙側(cè)關(guān)節(jié)周圍軟組織腫脹消失，關(guān)節(jié)間隙狹窄明顯改善，與陽性藥組比較關(guān)節(jié)間隙明顯恢復(fù)。秦威組：見模型大鼠雙側(cè)關(guān)節(jié)周圍軟組織腫脹消失，關(guān)節(jié)間隙狹窄有所改善，但與陽性藥組比較各項指標(biāo)改善欠佳。其他各組與Ⅱ型膠原組及病證模型組比較關(guān)節(jié)周圍軟組織腫脹明顯改善，但關(guān)節(jié)間隙及骨侵蝕無明顯變化�？瞻捉M Ⅱ型膠原組 病證模型組 陽性藥組
【參考文獻】

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