發(fā)布時(shí)間：2020-10-16 01:14

　　 可變剪接發(fā)生在前體m RNA向成熟m RNA的轉(zhuǎn)換過(guò)程中,是轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控和產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性的重要機(jī)制�？勺兗艚釉谡婧松镏衅毡榇嬖�,并且在生物體發(fā)育的不同階段及不同組織或器官中,基因的剪接方式是不斷變化的,以此調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡。神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育是一個(gè)極其復(fù)雜且嚴(yán)密的過(guò)程,可變剪接在神經(jīng)發(fā)育的各個(gè)階段都發(fā)揮著重要的作用,特定階段特定神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)剪接方式的改變往往造成神經(jīng)系統(tǒng)的功能異常。具有高度保守性的Smek蛋白,可以調(diào)控Wnt/Ryk信號(hào)通路影響小鼠胚胎大腦皮層早期發(fā)育。小鼠胚胎早期的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化對(duì)于神經(jīng)發(fā)育的正常進(jìn)行至關(guān)重要,所以本論文中主要針對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的分化過(guò)程中敲除Smek基因引起的其他相關(guān)基因的可變剪接事件,以及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響進(jìn)行研究。首先采用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)所提取的神經(jīng)干細(xì)胞含ploy(A)尾的RNA構(gòu)建文庫(kù),接著進(jìn)行單端測(cè)序,測(cè)序數(shù)據(jù)為50bp長(zhǎng)度的讀段。樣本分為兩組:野生型組和敲除Smek基因組,每組三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。同時(shí)為了更好地研究胚胎的神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中的可變剪接,分別選取神經(jīng)干細(xì)胞分化第0天、第2天和第6天(測(cè)序部分由合作者完成)。然后對(duì)這些神經(jīng)干細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,把原始序列比對(duì)到全基因組,再裝配出相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組,和篩選出顯著性差異表達(dá)的基因、初級(jí)轉(zhuǎn)錄本和異構(gòu)體等,為后續(xù)分析差異表達(dá)和可變剪接事件做準(zhǔn)備。其次,采用cuffdiff對(duì)經(jīng)過(guò)預(yù)處理得到的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性基因差異表達(dá)的分析。篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著性差異表達(dá)的基因,然后通過(guò)功能富集分析軟件GO(Gene Ontology)對(duì)它們進(jìn)行分析,從而得到與Smek基因相關(guān)的基因表達(dá)量變化對(duì)生物體的功能影響。同時(shí),也研究了不同時(shí)間點(diǎn)敲除Smek基因和野生型中顯著性差異表達(dá)的基因?qū)ι窠?jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響。分析結(jié)果顯示,這些差異表達(dá)的基因參與了神經(jīng)元的形成等,如參與神經(jīng)元形成Egr2、Dlx2等基因和參與神經(jīng)元分化的Miat、Gsx1等基因表達(dá)量發(fā)生了顯著改變。第三,對(duì)經(jīng)過(guò)預(yù)處理的測(cè)序數(shù)據(jù),通過(guò)Jensen-Shannon差異分析方法篩選出發(fā)生可變剪接的基因,并且通過(guò)GO對(duì)這些基因進(jìn)行生物學(xué)功能研究。同時(shí),可以得到這些基因的可變剪接模式,相對(duì)于其他生物學(xué)方法只能得到一種剪接模式,本論文的方法可以分析多種模式。由分析結(jié)果可知,敲除Smek基因引起了相關(guān)基因的剪接變化,產(chǎn)生了不同功能的蛋白質(zhì),對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的正常分化等過(guò)程帶來(lái)影響,如Ank3、Clasp2等參與神經(jīng)元分化的細(xì)胞形態(tài)的發(fā)生,Ppfibp2、Ncam1等參與神經(jīng)元形成的基因翻譯出不同于正常生物體的功能蛋白質(zhì)。最后,總結(jié)Smek基因的生物學(xué)功能和神經(jīng)發(fā)育的聯(lián)系。通過(guò)分析敲除Smek基因引起相關(guān)基因發(fā)生的可變剪接,一方面可以驗(yàn)證Smek基因的功能,另一方面研究Smek基因在神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中的重要作用。同時(shí)本論文的研究工作,也為未來(lái)診斷和治療與神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定一定的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：南京航空航天大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R3416
【部分圖文】：

研究方案與創(chuàng)新性論文的總體研究方案在圖 1.1 所描述，主要是使用生物信息學(xué)的方法來(lái)識(shí)別剪接變剪接的基因、可變剪接的模式，以及這些基因的功能富集分析，從而分析發(fā)生因?qū)ι窠?jīng)干細(xì)胞的分化的影響。

然后測(cè)序。在進(jìn)行測(cè)序時(shí)，主出質(zhì)量分?jǐn)?shù)[62]。根據(jù)測(cè)序從 cDNAingle-end) 和雙端(paired-end)[63]，于后續(xù)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的分析。測(cè)序過(guò)程[64]的流程圖如圖 3.1。

圖 4.1 Basic Statistics報(bào)告 4.1，可以得知原始讀段的測(cè)序平臺(tái)、讀段個(gè)數(shù)和序列長(zhǎng)度等信息，此圖是的一個(gè)統(tǒng)計(jì)。tQC 質(zhì)量檢測(cè)的結(jié)果報(bào)告 Per base sequence quality 如圖 4.2。
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本文編號(hào)：2842521