目的:制備嵌合結(jié)腸癌新抗原Adpgk的乙肝病毒核心抗原(HBcAg)病毒樣顆粒(VLP)。方法:通過(guò)重疊PCR將新抗原編碼序列插入截短型HBcAg(1～149 aa)第78、79位氨基酸編碼序列之間,并將融合基因克隆至原核表達(dá)載體pET-22b(+),轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,利用親和層析與超濾管純化濃縮目的蛋白,通過(guò)Western印跡、粒徑分析與透射電鏡成像鑒定嵌合病毒樣顆粒。結(jié)果:構(gòu)建了pET-22b(+)重組表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3),SDS-PAGE結(jié)果顯示在30℃經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h即可獲得高濃度的可溶性蛋白,通過(guò)親和層析與超濾濃縮得到了純度良好的目的蛋白;Western印跡結(jié)果表明連有His標(biāo)簽的目的蛋白獲得表達(dá)且濃度較高;透射電鏡成像可見(jiàn)密集的大小均一、空心的球形病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)。結(jié)論:制備出濃度與純度良好且組裝正確的嵌合HBcAg VLP。
【部分圖文】：

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，Adpgk-HBcAg pET-22b(+)菌體裂解沉淀中相對(duì)分子質(zhì)量15×103偏上位置處出現(xiàn)特征條帶；在Adpgk-RD-HBcAg pET-22b（+）菌體裂解上清的同樣位置出現(xiàn)了特征條帶，而其沉淀中未出現(xiàn)該特征條帶，說(shuō)明RD的引入增加了目的蛋白的水溶性。未誘導(dǎo)的菌體在該位置出現(xiàn)較淺的特征條帶，應(yīng)為本底表達(dá)。見(jiàn)圖2。2.3 Western印跡檢測(cè)Adpgk-RD-HBcAg重組蛋白的表達(dá)

Adpgk-RD-HBcAg pET-22b（+）重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3）感受態(tài)細(xì)胞，1mmol/L IPTG、30℃誘導(dǎo)5 h，菌體超聲波裂解、離心后，通過(guò)Ni+親和層析柱純化并超濾濃縮，取菌體裂解上清與蛋白濃縮樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。圖4泳道1為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體裂解、離心后的上清檢測(cè)結(jié)果，條帶致密是因菌體內(nèi)雜蛋白所致，而在預(yù)估位置未出現(xiàn)明顯條帶，表明未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)時(shí)目的蛋白表達(dá)量較低。泳道2為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的結(jié)果，由于蛋白未經(jīng)純化，所以條帶依然非常致密，但在目的蛋白位置15×103偏上處可見(jiàn)一條明顯的粗條帶，表明IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的即為目的蛋白Adpgk-RD-HBcAg，且誘導(dǎo)表達(dá)量較高。泳道3為誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白經(jīng)Ni+柱純化與超濾后的結(jié)果，可見(jiàn)條帶致密現(xiàn)象有明顯改善，而且在預(yù)估位置有明顯條帶出現(xiàn)，說(shuō)明蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功且純化效果較好。但在泳道3中也略微可見(jiàn)一些其他蛋白條帶，這是因?yàn)樵谔烊痪w中也會(huì)有一些Ni+親和的蛋白。圖3 Western印跡檢測(cè)Adpgk-RD-HBcAg重組蛋白的表達(dá)

Western印跡檢測(cè)Adpgk-RD-HBcAg重組蛋白的表達(dá)
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