HAb18G/CD147分子是本實(shí)驗(yàn)室前期利用肝癌特異性抗體HAb18,篩選人肝癌組織cDNA表達(dá)文庫(kù)所獲得的一種新的肝癌相關(guān)抗原,是一種分子量約為35~65kDa的跨膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族成員。研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面的HAb18G/CD147分子能夠參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控以及侵襲、轉(zhuǎn)移等多種過程,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示,腫瘤細(xì)胞表面CD147分子表達(dá)量的高低直接影響著腫瘤的治療效果和預(yù)后。近年來,越來越多的注意力集中在CD147分子與免疫相關(guān)性疾病的研究中,尤其是CD147分子與T細(xì)胞及其效應(yīng)細(xì)胞亞群異�；罨閷�(dǎo)的免疫炎癥性疾病的研究。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明上調(diào)表達(dá)的CD147分子與T細(xì)胞及其效應(yīng)細(xì)胞活化相關(guān)免疫炎性疾病之間存在著顯著的關(guān)聯(lián)性。免疫突觸是T細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞在相互結(jié)合的交界面所形成的一種超分子活化簇結(jié)構(gòu),參與了T細(xì)胞的活化增殖過程。本科室前期研究表明,HAb18G/CD147分子在TCR/CD3活化的T細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),并可能與TCR輔受體CD4/CD8分子以及脂筏標(biāo)記分子CD48共定位于免疫突觸中,提示CD147分子可能與免疫突觸的形成有關(guān)。考慮到很多慢性炎癥性自身免疫病存在T細(xì)胞的異�；罨�,并伴隨CD147分子的顯著上調(diào),那么,cd147是否能夠通過參與免疫突觸的形成介導(dǎo)t細(xì)胞的活化從而促進(jìn)相關(guān)自身免疫病的發(fā)生發(fā)展呢?本研究針對(duì)上述科學(xué)問題,旨在闡明hab18g/cd147作為t細(xì)胞活化相關(guān)抗原在免疫突觸形成中的作用及其參與t細(xì)胞活化的具體機(jī)制,并為后期開發(fā)靶向cd147治療t細(xì)胞活化相關(guān)自身免疫病的藥物提供一定的理論依據(jù)。研究分為以下四部分:第一部分:cd147分子在t細(xì)胞中的分布和表達(dá)研究。cd147分子早已被證明與t淋巴細(xì)胞的活化相關(guān)。但是,其在不同t細(xì)胞亞群的分布以及對(duì)不同刺激條件的表達(dá)變化還不是很清楚。我們首先分析了不同亞群cd4+t細(xì)胞表面cd147分子的表達(dá)情況以及不同刺激活化條件下各t淋巴細(xì)胞亞群膜表面cd147分子的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),未活化的cd4+t表面cd147分子雖有表達(dá),但水平較低;在不同的誘導(dǎo)條件下,cd4+t細(xì)胞活化后cd147分子的表達(dá)均有明顯上調(diào),以cd3和cd28雙抗體刺激條件下cd147上調(diào)最為明顯,且具有一定的時(shí)效性。cd147分子在記憶性t細(xì)胞膜表面的表達(dá)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于幼稚性t細(xì)胞,而且活化后記憶性t細(xì)胞膜表面cd147分子的表達(dá)也明顯高于幼稚性t細(xì)胞,提示cd147分子可能在記憶性t淋巴細(xì)胞的活化中發(fā)揮更加重要的作用。鑒于此,我們后續(xù)的實(shí)驗(yàn)均選擇cd147表達(dá)相對(duì)較高的記憶性t細(xì)胞作為研究對(duì)象進(jìn)行免疫突觸和t細(xì)胞活化相關(guān)實(shí)驗(yàn)。第二部分:cd147分子在免疫突觸中的定位及作用研究。在確定cd147高表達(dá)于活化t細(xì)胞表面的基礎(chǔ)之上,我們進(jìn)一步觀察了cd147分子是否存在于活化的t細(xì)胞免疫突觸中,即參與免疫突觸的形成,以及其在免疫突觸中的具體定位。采用jurkatt rajib細(xì)胞模型,模擬人體內(nèi)t apc細(xì)胞之間免疫突觸的形成,激光共聚焦顯微鏡和免疫膠體金電鏡結(jié)果均表明cd147分子存在于t b細(xì)胞形成的免疫突觸中。通過對(duì)免疫突觸橫斷面結(jié)構(gòu)的三維立體重建,我們發(fā)現(xiàn)90%左右的cd147分子與外周超分子活化簇標(biāo)志分子cd2存在共定位,提示cd147分子主要分布于外周超分子活化簇區(qū)域。我們進(jìn)一步通過慢病毒載體技術(shù)分別干涉了jurkatt和rajib細(xì)胞表面cd147分子的表達(dá),觀察其對(duì)免疫突觸形成的影響。發(fā)現(xiàn)下調(diào)t細(xì)胞膜變面的cd147分子后,t-b細(xì)胞之間未見明顯的免疫突觸形成。然而,下調(diào)b細(xì)胞的cd147并不影響免疫突觸的形成。據(jù)此,我們得出結(jié)論:cd147分子在免疫突觸形成中確實(shí)發(fā)揮了重要的作用,而且主要是t細(xì)胞上的cd147分子發(fā)揮作用。第三部分:cd147分子介導(dǎo)人體內(nèi)t細(xì)胞免疫突觸形成及活化研究。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步應(yīng)用人體內(nèi)t-apc取代了體外細(xì)胞系jurkatt-rajib作為免疫突觸模型,更為真實(shí)的反映了體內(nèi)cd147分子參與免疫突觸的情況。實(shí)驗(yàn)將體外分離的單核細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞,通過激光共聚焦顯微鏡觀察其與記憶性t細(xì)胞之間免疫突觸的形成情況,以確定cd147分子在人體內(nèi)t細(xì)胞免疫突觸形成中的定位,并進(jìn)一步研究了cd147分子對(duì)免疫突觸形成和t細(xì)胞活化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的cd147分子在人體內(nèi)活化的t細(xì)胞中也募集于免疫突觸部位。應(yīng)用cd147特異性單抗hab18不僅可以抑制t細(xì)胞表面早期活化指標(biāo)cd69分子的表達(dá),而且也下調(diào)了t細(xì)胞表面晚期活化指標(biāo)cd25分子的表達(dá);同時(shí)還顯著減少了il-2的分泌水平。這些結(jié)果均提示cd147分子在活化t細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要的作用。第四部分:cd147分子參與免疫突觸和t細(xì)胞活化的分子機(jī)制研究。cd147分子聚集于免疫突觸中并在t細(xì)胞的活化中起到一定的作用。可是由于cd147分子的胞內(nèi)段很短,目前對(duì)于其是否能夠參與信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)尚無確切的研究細(xì)節(jié)。我們根據(jù)文獻(xiàn)相關(guān)結(jié)果,考慮cd147分子可能與其它分子相互作用參與突觸形成及t細(xì)胞活化過程。研究發(fā)現(xiàn),cd147分子下調(diào)后,并不影響膜表面cd3、cd2、lfa-1以及cd48分子的表達(dá),但是cd98分子的表達(dá)卻明顯下調(diào)。而且通過三維立體結(jié)構(gòu)重建技術(shù),我們?cè)趖-b細(xì)胞形成的突觸部位可以觀察到90%以上的cd147和cd98分子的共定位,提示cd147可能與cd98相互作用共同參與免疫突觸的形成及其后續(xù)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。為了進(jìn)一步闡明cd147作用的主要信號(hào)分子,我們又分別應(yīng)用了cba和luminex等高通量技術(shù)檢測(cè)了參與t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要分子,并通過western予以驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn),應(yīng)用cd147單克隆抗體阻斷后,t細(xì)胞內(nèi)p-zap70、p-erk、p-c-jun、p-creb以及p-lat的水平明顯降低,提示cd147分子參與t細(xì)胞活化的功能可能與這些分子相關(guān)。cd147能夠從mapk以及pi3k-akt等多條信號(hào)通路參與t細(xì)胞的活化過程,這也為后期開發(fā)hab18作為一種靶向cd147治療t細(xì)胞活化相關(guān)自身免疫病的藥物提供了一定的理論依據(jù)。綜上所述,cd147分子高表達(dá)于活化的t細(xì)胞表面,參與了t-apc細(xì)胞之間免疫突觸的形成并定位于外周超分子活化簇區(qū)域。干涉t細(xì)胞表面的cd147分子能夠顯著降低免疫突觸的形成率;應(yīng)用cd147特異性單抗hab18能夠從多條信號(hào)通路抑制t細(xì)胞的活化。cd147分子可能與cd98相互作用共同參與免疫突觸的形成及t細(xì)胞的活化過程。本研究首次闡明了cd147分子在免疫突觸形成及t細(xì)胞活化過程中的重要作用,并揭示了CD147分子調(diào)控T細(xì)胞活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,為基于靶向CD147的抗炎治療提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
縮略語表
中文摘要
ABSTRACT
前言
文獻(xiàn)回顧
第一部分 CD147分子在T細(xì)胞中的分布與表達(dá)
    1 材料
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
第二部分 CD147分子在免疫突觸中的定位及作用研究
    1 材料
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
第三部分 CD147分子介導(dǎo)人體內(nèi)T細(xì)胞免疫突觸的形成及活化
    1 材料
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
第四部分 CD147分子參與免疫突觸形成介導(dǎo)T細(xì)胞活化的分子機(jī)制研究
    1 材料
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果
致謝

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