HAb18G/CD147分子是本實驗室前期利用肝癌特異性抗體HAb18,篩選人肝癌組織cDNA表達文庫所獲得的一種新的肝癌相關抗原,是一種分子量約為35~65kDa的跨膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族成員。研究發(fā)現高表達于多種腫瘤細胞表面的HAb18G/CD147分子能夠參與腫瘤細胞的生長調控以及侵襲、轉移等多種過程,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。進一步的研究結果顯示,腫瘤細胞表面CD147分子表達量的高低直接影響著腫瘤的治療效果和預后。近年來,越來越多的注意力集中在CD147分子與免疫相關性疾病的研究中,尤其是CD147分子與T細胞及其效應細胞亞群異�；罨閷У拿庖哐装Y性疾病的研究。多項實驗結果表明上調表達的CD147分子與T細胞及其效應細胞活化相關免疫炎性疾病之間存在著顯著的關聯性。免疫突觸是T細胞與抗原提呈細胞在相互結合的交界面所形成的一種超分子活化簇結構,參與了T細胞的活化增殖過程。本科室前期研究表明,HAb18G/CD147分子在TCR/CD3活化的T細胞中表達上調,并可能與TCR輔受體CD4/CD8分子以及脂筏標記分子CD48共定位于免疫突觸中,提示CD147分子可能與免疫突觸的形成有關�？紤]到很多慢性炎癥性自身免疫病存在T細胞的異�；罨�,并伴隨CD147分子的顯著上調,那么,cd147是否能夠通過參與免疫突觸的形成介導t細胞的活化從而促進相關自身免疫病的發(fā)生發(fā)展呢?本研究針對上述科學問題,旨在闡明hab18g/cd147作為t細胞活化相關抗原在免疫突觸形成中的作用及其參與t細胞活化的具體機制,并為后期開發(fā)靶向cd147治療t細胞活化相關自身免疫病的藥物提供一定的理論依據。研究分為以下四部分:第一部分:cd147分子在t細胞中的分布和表達研究。cd147分子早已被證明與t淋巴細胞的活化相關。但是,其在不同t細胞亞群的分布以及對不同刺激條件的表達變化還不是很清楚。我們首先分析了不同亞群cd4+t細胞表面cd147分子的表達情況以及不同刺激活化條件下各t淋巴細胞亞群膜表面cd147分子的表達變化。實驗發(fā)現,未活化的cd4+t表面cd147分子雖有表達,但水平較低;在不同的誘導條件下,cd4+t細胞活化后cd147分子的表達均有明顯上調,以cd3和cd28雙抗體刺激條件下cd147上調最為明顯,且具有一定的時效性。cd147分子在記憶性t細胞膜表面的表達要遠遠高于幼稚性t細胞,而且活化后記憶性t細胞膜表面cd147分子的表達也明顯高于幼稚性t細胞,提示cd147分子可能在記憶性t淋巴細胞的活化中發(fā)揮更加重要的作用。鑒于此,我們后續(xù)的實驗均選擇cd147表達相對較高的記憶性t細胞作為研究對象進行免疫突觸和t細胞活化相關實驗。第二部分:cd147分子在免疫突觸中的定位及作用研究。在確定cd147高表達于活化t細胞表面的基礎之上,我們進一步觀察了cd147分子是否存在于活化的t細胞免疫突觸中,即參與免疫突觸的形成,以及其在免疫突觸中的具體定位。采用jurkatt rajib細胞模型,模擬人體內t apc細胞之間免疫突觸的形成,激光共聚焦顯微鏡和免疫膠體金電鏡結果均表明cd147分子存在于t b細胞形成的免疫突觸中。通過對免疫突觸橫斷面結構的三維立體重建,我們發(fā)現90%左右的cd147分子與外周超分子活化簇標志分子cd2存在共定位,提示cd147分子主要分布于外周超分子活化簇區(qū)域。我們進一步通過慢病毒載體技術分別干涉了jurkatt和rajib細胞表面cd147分子的表達,觀察其對免疫突觸形成的影響。發(fā)現下調t細胞膜變面的cd147分子后,t-b細胞之間未見明顯的免疫突觸形成。然而,下調b細胞的cd147并不影響免疫突觸的形成。據此,我們得出結論:cd147分子在免疫突觸形成中確實發(fā)揮了重要的作用,而且主要是t細胞上的cd147分子發(fā)揮作用。第三部分:cd147分子介導人體內t細胞免疫突觸形成及活化研究。本實驗進一步應用人體內t-apc取代了體外細胞系jurkatt-rajib作為免疫突觸模型,更為真實的反映了體內cd147分子參與免疫突觸的情況。實驗將體外分離的單核細胞誘導為成熟的巨噬細胞和樹突狀細胞,通過激光共聚焦顯微鏡觀察其與記憶性t細胞之間免疫突觸的形成情況,以確定cd147分子在人體內t細胞免疫突觸形成中的定位,并進一步研究了cd147分子對免疫突觸形成和t細胞活化的影響。結果發(fā)現上調表達的cd147分子在人體內活化的t細胞中也募集于免疫突觸部位。應用cd147特異性單抗hab18不僅可以抑制t細胞表面早期活化指標cd69分子的表達,而且也下調了t細胞表面晚期活化指標cd25分子的表達;同時還顯著減少了il-2的分泌水平。這些結果均提示cd147分子在活化t細胞的過程中發(fā)揮著重要的作用。第四部分:cd147分子參與免疫突觸和t細胞活化的分子機制研究。cd147分子聚集于免疫突觸中并在t細胞的活化中起到一定的作用。可是由于cd147分子的胞內段很短,目前對于其是否能夠參與信號的轉導尚無確切的研究細節(jié)。我們根據文獻相關結果,考慮cd147分子可能與其它分子相互作用參與突觸形成及t細胞活化過程。研究發(fā)現,cd147分子下調后,并不影響膜表面cd3、cd2、lfa-1以及cd48分子的表達,但是cd98分子的表達卻明顯下調。而且通過三維立體結構重建技術,我們在t-b細胞形成的突觸部位可以觀察到90%以上的cd147和cd98分子的共定位,提示cd147可能與cd98相互作用共同參與免疫突觸的形成及其后續(xù)信號的轉導過程。為了進一步闡明cd147作用的主要信號分子,我們又分別應用了cba和luminex等高通量技術檢測了參與t細胞信號轉導的主要分子,并通過western予以驗證。結果發(fā)現,應用cd147單克隆抗體阻斷后,t細胞內p-zap70、p-erk、p-c-jun、p-creb以及p-lat的水平明顯降低,提示cd147分子參與t細胞活化的功能可能與這些分子相關。cd147能夠從mapk以及pi3k-akt等多條信號通路參與t細胞的活化過程,這也為后期開發(fā)hab18作為一種靶向cd147治療t細胞活化相關自身免疫病的藥物提供了一定的理論依據。綜上所述,cd147分子高表達于活化的t細胞表面,參與了t-apc細胞之間免疫突觸的形成并定位于外周超分子活化簇區(qū)域。干涉t細胞表面的cd147分子能夠顯著降低免疫突觸的形成率;應用cd147特異性單抗hab18能夠從多條信號通路抑制t細胞的活化。cd147分子可能與cd98相互作用共同參與免疫突觸的形成及t細胞的活化過程。本研究首次闡明了cd147分子在免疫突觸形成及t細胞活化過程中的重要作用,并揭示了CD147分子調控T細胞活化的信號轉導通路,為基于靶向CD147的抗炎治療提供了新的思路。
【學位單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2014
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
縮略語表
中文摘要
ABSTRACT
前言
文獻回顧
第一部分 CD147分子在T細胞中的分布與表達
    1 材料
    2 方法
    3 結果
    4 討論
第二部分 CD147分子在免疫突觸中的定位及作用研究
    1 材料
    2 方法
    3 結果
    4 討論
第三部分 CD147分子介導人體內T細胞免疫突觸的形成及活化
    1 材料
    2 方法
    3 結果
    4 討論
第四部分 CD147分子參與免疫突觸形成介導T細胞活化的分子機制研究
    1 材料
    2 方法
    3 結果
    4 討論
小結
參考文獻
個人簡歷和研究成果
致謝

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本文編號：2831448