豬是人類最早馴化的動(dòng)物之一,中國(guó)人馴養(yǎng)家豬的歷史可以追溯到新石器時(shí)代。而近年來(lái),與豬相關(guān)的研究課題一直是研究熱點(diǎn)。一方面,豬是畜牧經(jīng)濟(jì)的重要物種,豬的抗病研究與人民的生產(chǎn)生活息息相關(guān)；另一方面,豬的生理構(gòu)造與人類更接近,以豬作為模擬人類疾病模型的模式動(dòng)物能幫助科學(xué)家攻克諸多疾病。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)又稱藍(lán)耳病病毒,具有超強(qiáng)傳染性。高致病性藍(lán)耳病會(huì)導(dǎo)致母豬繁殖功能障礙和仔豬死亡,對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失�？茖W(xué)家們采用各種手段致力于攻克藍(lán)耳病,但尚未取得決定性的進(jìn)展。本研究中,我們?cè)噲D通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法培育自身能夠抗藍(lán)耳病的新品系豬種。過(guò)去研究發(fā)現(xiàn),HDAC6是一種特殊的組蛋白去乙酰化酶,除了調(diào)控組蛋白的乙�；酵�,其對(duì)胞質(zhì)中微管蛋白的乙�；酵瑯泳哂姓{(diào)節(jié)作用。HDAC6蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中,對(duì)細(xì)胞遷移、免疫突觸形成、病毒入侵時(shí)對(duì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)具有重要作用。因此,我們推測(cè)過(guò)表達(dá)HDAC6基因會(huì)增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)病毒入侵的抵抗作用。在本研究中,我們通過(guò)轉(zhuǎn)基因克隆的手段,制備了過(guò)表達(dá)HDAC6轉(zhuǎn)基因的豬,并通過(guò)體外細(xì)胞攻毒試驗(yàn)和體內(nèi)攻毒試驗(yàn)證明了其抗病功能。首先我們構(gòu)建了表達(dá)豬jHDAC'6基因的載體,通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方式將載體轉(zhuǎn)染到豬胎兒成纖維細(xì)胞內(nèi)。通過(guò)單克隆細(xì)胞篩選以及體細(xì)胞核移植的手段,得到25頭F0代的過(guò)表達(dá)HDAC6轉(zhuǎn)基因克隆母豬。我們選擇Fo代的部分陽(yáng)性克隆母豬傳代配種,得到80頭F1代HDAC6轉(zhuǎn)基因豬。接下來(lái)通過(guò)分子檢測(cè)確定了陽(yáng)性率和表達(dá)量,證明了HDAC6基因過(guò)表達(dá),實(shí)現(xiàn)了種系傳遞。我們選取PRRSA/攻毒中常用的PRRSV CH1a毒株,利用F1代豬制備的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性豬和陰性豬的肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs),設(shè)計(jì)了24 hpi,48hpi,72 hpi三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)攻毒后轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性PAMs組的帶毒量顯著低于陰性PAMs組,證明了細(xì)胞水平上過(guò)表達(dá)HDAC6對(duì)PRRSV的抵抗作用。根據(jù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,我們選擇4-6周的F1代仔豬共42頭進(jìn)行活體PRRSV攻毒試驗(yàn)和同居感染實(shí)驗(yàn)。毒株選取了在我國(guó)流行的高致病性毒株P(guān)RRSV NVDC JXAl,攻毒劑量為100 TCIDso。通過(guò)嚴(yán)格的個(gè)體攻毒和同居實(shí)驗(yàn),我們證明了HDACt過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因豬在藍(lán)耳病病毒入侵時(shí),能夠阻礙病毒復(fù)制,延緩發(fā)病時(shí)間,減弱發(fā)病癥狀。實(shí)驗(yàn)證明過(guò)表達(dá)HDAC6轉(zhuǎn)基因豬在體外攻毒實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)攻毒實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出對(duì)藍(lán)耳病病毒的抗性。過(guò)去研究表明,Leptin基因(obese基因,ob)在血糖和脂肪代謝通路中起到重要調(diào)控作用。Leptin通過(guò)影響下丘腦的激素分泌,從而對(duì)食物攝入,能量消耗以及糖代謝和脂代謝起到調(diào)控作用。obese基因自然突變小鼠(ob/ob、鼠)模型由于其肥胖及相關(guān)并發(fā)癥被廣泛用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)及藥物篩選。然而Leptin突變小鼠模型在糖尿病藥物臨床試驗(yàn)中,未能反映治療藥物誘發(fā)心臟病的副作用。所以我們需要與人類生理結(jié)構(gòu)更為接近的模式動(dòng)物。小型豬與人類的脂肪積累方式和藥物敏感度更接近。因此為了建立更適合人類肥胖癥的疾病模型,本研究以小型豬為模式動(dòng)物進(jìn)行Leptin基因敲除。我們利用基因定點(diǎn)修飾的新技術(shù)鋅指核酸酶敲除技術(shù)實(shí)現(xiàn)了Leptin基因定點(diǎn)突變,篩選到了11個(gè)陽(yáng)性突變克隆,突變率達(dá)到了8.3%。通過(guò)體細(xì)胞移植,共獲得克隆豬18頭,存活11頭,經(jīng)過(guò)PCR測(cè)序驗(yàn)證,2頭為雙敲個(gè)體,有7頭單敲個(gè)體,2頭陰性個(gè)體。并且通過(guò)傳代配種,獲得了72頭F1代Leptin基因敲除豬,其中包括35頭單敲個(gè)體,37頭陰性個(gè)體。通過(guò)該方法可在一年時(shí)間內(nèi)獲得含有兩個(gè)等位基因同時(shí)發(fā)生敲除的克隆豬,極大的縮短了實(shí)驗(yàn)周期。Leptin雙敲豬相比野生型豬表現(xiàn)出體型肥胖、高體脂含量、高血糖、高血脂、胰島素抵抗等特性,符合肥胖疾病模型應(yīng)有的病理特征。接下來(lái)我們將利用此疾病模型,展開(kāi)更多的病理學(xué)和生理學(xué)研究。綜上所述,我們通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法建立了HDAC6過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因豬,證明過(guò)表達(dá)豬的HDAC6基因?qū)τ谒{(lán)耳病病毒的入侵和復(fù)制有抵抗作用,為預(yù)防和治療藍(lán)耳病提供了新的思路和途徑。同時(shí)我們還首次利用鋅指核酸酶技術(shù)構(gòu)建了Leptin敲除的肥胖疾病模型豬,為研究人類肥胖引發(fā)的相關(guān)疾病提供了新的途徑。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：S858.28;R589.2;R-332
【部分圖文】：

此后，ＰＲＲＳＶ在中國(guó)廣泛流行，并產(chǎn)生了各種突變的毒株（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，２００６；ＧａｏｅｔａＵ逡逑２００４）。自２００６年６月Ｗ來(lái)，我國(guó)爆發(fā)了一種導(dǎo)致豬出現(xiàn)高熱、皮膚發(fā)巧、離發(fā)滿率和高死ｔ率逡逑的流行病，在多省市流行（圖１－２）。巧致病性Xi耳病的捕狀主耍巧現(xiàn)為楠豬持續(xù)商熱，Ｗ超過(guò)４１邋Ｃ逡逑Ｈ天Ｗ上，咳嗽氣喘，結(jié)膜炎，部分豬后軀無(wú)力，共濟(jì)失調(diào)等癥狀，仔豬的發(fā)病率高達(dá)１００％，逡逑巧豬流產(chǎn)率也商達(dá)３０％ｙ＞上，而成年巧肥豬也可能發(fā)病致死（農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局．２００７）。根據(jù)Ｗ＿ｈ特征，逡逑我閩科學(xué)家由此分離到了新的ＰＲＲＳＶ鴻株，即高致巧性豬繁殖叫巧吸綜合征病靖－ＨＰ邋ＰＲＲＳＶ。逡逑ＨＰ邋ＰＲＲＳＶ是北美亞型的一種新的突變毒株，在化ｐ２蛋白上發(fā)生了氨基酸殘基的缺失突變巧ａｎ邋ｅｔ逡逑ａｌ．．邋２００７）。這次高致病性盛耳病的爆發(fā)對(duì)我園的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨NB的打擊，經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)１００億逡逑元人民幣。自此，高致病性ＰＲＲＳＶ的研究和防治就成為

眼部出現(xiàn)結(jié)膜炎，眼隱水腫、分泌物多；咳嗽、氣喘等呼吸道癥狀。部分病豬還會(huì)出現(xiàn)四肢乏力、逡逑顫抖，或不能站立、共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀。ＰＲＲＳＶ可通過(guò)血液循環(huán)穿過(guò)胎盤使胎豬受到感染，逡逑從而導(dǎo)致巧娠母豬出現(xiàn)流產(chǎn)，產(chǎn)木乃伊胎和死胎（圖１－３）。高致病性ＰＲＲＳＶ具有較強(qiáng)的傳染力，逡逑較長(zhǎng)的流行期，在一個(gè)地區(qū)內(nèi)傳播數(shù)月無(wú)明顯好轉(zhuǎn)，常規(guī)治巧不能產(chǎn)生顯著效果（Ｔｉａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００７）。逡逑ＰＲＲＳＶ主要通過(guò)豬之間的身體接觸、粘液接觸和空氣傳播等方式傳染。其中身體接觸包括逡逑共同飼養(yǎng)的豬互相觸碰，Ｗ及其分泌物和排泄物之間的互相沾染。粘液接觸范圍包括豬的唾液、逡逑精液、乳汁、糞便、血液等帶有病毒的分泌物。還有間接接觸也可能導(dǎo)致Ｐ民民ＳＶ傳播，比如豬逡逑場(chǎng)工作人員的服裝、手套、鞋、帽和飼養(yǎng)籠、床等接觸過(guò)發(fā)病豬的物品�？諝鈧鞑ナ侵冈谝欢l逡逑件的風(fēng)速、風(fēng)向、濕度、溫度下，ＰＲＲＳＶ可Ｗ通過(guò)空氣傳播到周圍地區(qū)，造成大面積影響（Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ逡逑ｅｔａｌ．．邋２０１１）。因此一旦某豬場(chǎng)化現(xiàn)ＰＲＲＳＶ感染，同地區(qū)的周邊豬場(chǎng)很容易受到傳染。除此之外，逡逑豬場(chǎng)容易滋生的蚊陋蟲(chóng)等也可能作為ＰＲＲＳＶ傳播的載體，病毒在家蛹體內(nèi)甚至能保持活性超過(guò)逡逑１２邋ｈ。而鳥(niǎo)類、禽類也可能攜帶ＰＲＲＳＶ進(jìn)行更遠(yuǎn)距離的傳播（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ邋ｅｔ邋ａｈ，邋１９９７）。逡逑ＰＲＲＳＶ對(duì)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大危害

瑚逡逑、廣、＾＇＇邋？產(chǎn)＾邋＾逡逑六’逡逑圖１－２邋２００６年在中國(guó)多地爆發(fā)大規(guī)模藍(lán)耳病事件的地點(diǎn)示意圖（Ｔｉａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．．邋２００７）。逡逑巧ｇ．邋１－２邋Ｏｕｔｂｒｅａｋ邋ｓｉｔｅｓ邋ｏｆ邋化ｅ邋２００６邋ＰＲＲＳ邋ｅｐｉｄｅｍｉｃ邋ｉｎ邋Ｃｉｉｉｎａ（Ｔｉａｎ邋ｅｌ邋ａｌ＂邋２００７）．逡逑高致病性豬v愣〔≈沓絲桑蹋�；ｉ臭湀�(zhí)忱抖≈⒆賜�，还伴有踢娐灭嬰E擼錚矗潁悴⒊皺義閑程歟咨希黃し舴⒑歟糠種磯�、鼻尖、唆[�、尾部出血、疲血呈孜r焐�；食欲减退或废绝Ｕd義涎鄄砍魷紙崮ぱ�，眼隐水肿、分弥X鋃�；咳嗽、气喘等呼吸禈�(lè)⒆礎(chǔ)２糠植≈砘夠岢魷炙鬧αΑ㈠義喜�，幌娀能站立、共济失淀d壬窬⒆礎(chǔ)＃校遙遙櫻摯賞ü貉反┕ヅ淌固ブ硎艿礁腥荊義洗傭賈慮繕錟鋼沓魷至韃�，产木乃伊胎和藫匹（哇E保常�。高痔敗性Ｐ＿b遙櫻志哂薪锨康拇玖�，辶x轄銑さ牧饜釁�，哉浕庚_厙?guó)脑煫播数詳佫灭嬙好转，常箣呶莿x荒懿災(zāi)Чǎ裕椋幔鑠澹澹翦澹幔歟�，２００ＡP�。辶x希校遙遙櫻種饕ü碇淶納硤褰喲�、镇G航喲ズ涂掌サ確絞醬盡Ｆ渲猩硤褰喲グㄥ義瞎餐茄鬧砘ハ啻ヅ觶準(zhǔn)捌浞置諼錆團(tuán)判刮鎦淶幕ハ嗾慈盡Ｕ騁航喲シ段Оㄖ淼耐僖�、辶x暇�、葯┉、粪便、血液祬s脅《鏡姆置諼鎩；褂屑浣詠喲ヒ部贍艿賈攏忻衩瘢櫻執(zhí)

本文編號(hào)：2828633