發(fā)布時(shí)間：2020-08-15 09:03

【摘要】：炭疽是一種人畜共患的烈性傳染病,其病原菌是炭疽芽孢桿菌。炭疽芽孢曾多次被用于生物恐怖襲擊,也是潛在的生物戰(zhàn)劑。深入認(rèn)識(shí)炭疽芽孢桿菌的感染與致病機(jī)制,有助于炭疽預(yù)防與治療新方法的發(fā)現(xiàn),對(duì)維護(hù)生物安全有重要意義。炭疽芽孢桿菌的毒力因子主要包括莢膜和毒素。炭疽毒素包含三種蛋白質(zhì)成分:保護(hù)性抗原(PA),致死因子(LF)以及水腫因子(EF)。致死毒素(LT)由LF和PA構(gòu)成,LF借助PA進(jìn)入細(xì)胞,通過(guò)剪切絲裂原活化的蛋白激酶激酶(MAPKK)1-4、6和7而使相關(guān)通路失活。水腫毒素(ET)由EF與PA構(gòu)成,EF借助PA進(jìn)入細(xì)胞,能夠劇烈升高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平,影響機(jī)體相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。以往對(duì)炭疽毒素的研究主要集中于LT,而對(duì)ET在炭疽感染和死亡中發(fā)揮的作用還不是十分了解。炭疽芽孢可以通過(guò)呼吸道、皮膚或消化道感染宿主。通過(guò)呼吸道進(jìn)入體內(nèi)的炭疽芽孢在被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬后進(jìn)入局部淋巴結(jié),并萌發(fā)成繁殖體細(xì)菌。而在局部組織中萌發(fā)的炭疽芽孢,也能夠利用炭疽毒素破壞天然免疫屏障而進(jìn)入到局部淋巴結(jié)。巨噬細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵成員之一,本研究針對(duì)ET對(duì)巨噬細(xì)胞功能的抑制作用及其分子機(jī)制進(jìn)行了研究。首先在大腸桿菌中表達(dá)并純化野生型炭疽水腫因子EF,及腺苷環(huán)化酶活性關(guān)鍵氨基酸殘基突變的EF(H351R)和EF(H351A)。在體外非細(xì)胞反應(yīng)體系和CHO-k1細(xì)胞中,野生型EF表現(xiàn)出極高cAMP生成效率,而EF(H351R)和EF(H351A)催化產(chǎn)生c AMP的效率大幅降低但仍有殘留。在小鼠實(shí)驗(yàn)中,野生型或突變體EF與PA構(gòu)成的ET、ET(H351R)和ET(H351A)能造成不同程度的器官損傷和局部水腫,損傷嚴(yán)重程度與組織內(nèi)cAMP水平正相關(guān)。25-50μg的野生型ET可以造成小鼠死亡,而相同劑量的ET(H351R)或ET(H351A)對(duì)小鼠沒(méi)有致死性。以小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7作為細(xì)胞模型,對(duì)ET的作用效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。單核細(xì)胞成熟后可以分化成組織駐留表型和炎性表型兩種不同的亞群。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RAW264.7表面分子標(biāo)志顯示,在未經(jīng)處理或LPS單獨(dú)處理時(shí)細(xì)胞呈現(xiàn)CD14~+CD16/32~+的組織駐留表型,而ET與LPS共同刺激后這些細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃D14~(hi)CD16/32~-的表型。表達(dá)GFP蛋白的大腸桿菌能夠被巨噬細(xì)胞吞噬,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞的GFP陽(yáng)性率及每個(gè)細(xì)胞中GFP熒光強(qiáng)度,能夠反映巨噬細(xì)胞的吞噬功能和殺菌功能。結(jié)果顯示,經(jīng)ET預(yù)處理3h后的巨噬細(xì)胞吞噬功能沒(méi)有下降,但是對(duì)胞內(nèi)細(xì)菌的殺傷功能明顯減弱。而對(duì)巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子檢測(cè)表明,ET處理下調(diào)了促炎細(xì)胞因子TNF-α和MCP-1的產(chǎn)生而上調(diào)了抑炎細(xì)胞因子IL-10和IL-6的產(chǎn)生。這些現(xiàn)象提示,ET處理使RAW264.7細(xì)胞向M2型分化。進(jìn)一步利用新一代測(cè)序技術(shù),對(duì)ET、ET(H351A)、腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑Forskolin或PA處理后的RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析。相比PA處理組,ET、ET(H351A)和Forskolin處理分別使RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生了1228個(gè)、264個(gè)和211個(gè)基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)。對(duì)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平檢測(cè)的結(jié)果顯示cAMP水平升高與轉(zhuǎn)錄組差異程度具有正相關(guān)。從ET處理產(chǎn)生的差異基因篩選到了27個(gè)cAMP依賴基因,這些基因的功能主要與巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)有關(guān),而剩余的非cAMP依賴基因則主要參與細(xì)胞物質(zhì)、能量代謝等功能。通過(guò)KEGG信號(hào)通路聚類(lèi)分析ET處理產(chǎn)生的差異基因,發(fā)現(xiàn)TNF-α經(jīng)過(guò)MAPK和NF-kB信號(hào)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化這一途徑中有較多差異基因富集。通過(guò)western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ET處理抑制了MAPK蛋白家族成員ERK的磷酸化活化。而ET和ERK磷酸化抑制劑PD3125901處理RAW264.7細(xì)胞均能抑制細(xì)胞中TNF-α的轉(zhuǎn)錄活化與分泌。這提示,ET下調(diào)巨噬細(xì)胞TNF-α產(chǎn)生可能與ERK磷酸化抑制有關(guān)。ET處理還能抑制NF-kB結(jié)合位報(bào)告基因的活化以及下調(diào)TNF-α對(duì)NF-kB的激活。NF-kB抑制劑BAY 11-7082也能下調(diào)TNF-α基因啟動(dòng)子的活化。p65是最重要的NF-kB亞基。ET處理抑制了p65的磷酸化,減少了p65在細(xì)胞核中的定位。cAMP主要通過(guò)活化PKA發(fā)揮其活性。PKA抑制劑H89能夠逆轉(zhuǎn)ET對(duì)NF-kB轉(zhuǎn)錄活性的抑制。這些結(jié)果表明,ET可能通過(guò)PKA途徑抑制p65介導(dǎo)的TNF-α轉(zhuǎn)錄活化。以上結(jié)果表明,ET可以通過(guò)抑制ERK和NF-kB活化,減少巨噬細(xì)胞的TNF-α產(chǎn)生。綜上所述,本研究制備了野生型EF及其腺苷酸環(huán)化酶活性減弱的突變體EF(H351A)和EF(H351R),發(fā)現(xiàn)了ET對(duì)于巨噬細(xì)胞表面分子標(biāo)記改變和促炎功能的抑制;通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,揭示了ET對(duì)巨噬細(xì)胞免疫功能的調(diào)控主要與其腺苷酸環(huán)化酶活性相關(guān);進(jìn)一步的分子機(jī)制研究表明,ET可能通過(guò)PKA途徑抑制ERK和NF-kB活化,從而下調(diào)了巨噬細(xì)胞炎性因子TNF-α的產(chǎn)生。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R378
【圖文】：

圖 1 炭疽毒素作用模式圖[9]Figure1. Mode of action of anthrax toxins在炭疽感染中的作用根據(jù)炭疽芽孢進(jìn)入宿主機(jī)體的途徑，炭疽病有三種形式：皮膚、胃腸道炭疽（圖 2）。早期研究表明定殖的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞將炭疽芽孢吞特洛伊木馬”一樣將芽孢從外周部位帶到局部淋巴結(jié)。炭疽芽孢在局部淋成能產(chǎn)生毒素的細(xì)菌繁殖體[10]。近年來(lái)，有實(shí)驗(yàn)證明炭疽芽孢也能在鼻組織、腸相關(guān)淋巴組織或損傷的表皮軟組織中萌發(fā)，并開(kāi)始產(chǎn)生毒力因素和蛋白酶。這些毒力因子能夠降低機(jī)體的免疫反應(yīng)和增加組織通透性菌繁殖體進(jìn)入到局部淋巴結(jié)，這種感染模式被稱為“越獄模型”[11]。一旦結(jié)被炭疽毒素“攻破”，炭疽芽孢桿菌便能夠隨血液循環(huán)，引起菌血癥，宿主死亡。

圖 2 炭疽芽孢通過(guò)三種途徑進(jìn)入宿主[12]Figure 2.B. anthracis enters the host as a spore through threealternative ports對(duì)小鼠皮下注射重組表達(dá)的 ET 能造成嚴(yán)重的皮膚水腫，而全身攻毒則引起消化道液體聚集、肝水腫、嚴(yán)重組織損傷以及死亡[13,14]。對(duì)于小鼠，ET 的最低致死劑量是 20  30 μg，低于 LT 對(duì)小鼠的最低致死劑量（40  100 μg），這表明在炭疽芽孢桿菌致病過(guò)程中 ET 也發(fā)揮著重要的作用。除了在炭疽感染末期造成直接組織損傷以及引起死亡，ET 在炭疽感染初期能夠干擾宿主天然免疫反應(yīng)，促進(jìn)了全身感染的形成（圖 3）。在髓系細(xì)胞中特異性敲除 CMG2 的小鼠能夠耐受 Sterne 株炭疽芽孢及細(xì)菌繁殖體的攻毒，而野生型小鼠對(duì)這個(gè)菌株的攻毒高度敏感；另外，這些髓系細(xì)胞特異性敲除 CMG2 的小鼠對(duì) LT 和 ET 攻毒的敏感性沒(méi)有下降[15]，表明炭疽毒素對(duì)炭疽芽孢桿菌躲避髓系細(xì)胞的清除作用至關(guān)重要。敲除 EF 基因的炭疽芽孢桿菌 Sterne 株感染力下降

第 5 頁(yè)圖 3 炭疽毒素對(duì)巨噬細(xì)胞作用[12]Figure3. Effects of the anthrax toxins on macrophages作用的分子機(jī)制ET 的主要活性是將 ATP 轉(zhuǎn)化為 cAMP，cAMP 是一種在細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的信使，其濃度改變能夠引發(fā)復(fù)雜的生物效應(yīng)。但是我們對(duì) ET 引發(fā)的機(jī)體損 cAMP 水平升高之間的具體機(jī)制還不是十分了解。cAMP 是二級(jí)信使家族最早的成員，大量研究表明，cAMP 對(duì)包括阿米巴蟲(chóng)、和哺乳動(dòng)物等多種生物的細(xì)胞功有調(diào)控作用[24]。這個(gè)二級(jí)信使分子介導(dǎo)的生程包括記憶、代謝、記憶調(diào)控和免疫功能[25]。細(xì)胞內(nèi)的 cAMP 水平受到磷酸酶（phosphodiesterase，PDE）的嚴(yán)格調(diào)控，PDE 通過(guò)水解 cAMP 拮抗其信細(xì)胞內(nèi)的 AC 與 PDE 通常定位于不同的空間結(jié)構(gòu)，因而 cAMP 的產(chǎn)生與消

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本文編號(hào)：2793903