【摘要】：炭疽是一種人畜共患的烈性傳染病,其病原菌是炭疽芽孢桿菌。炭疽芽孢曾多次被用于生物恐怖襲擊,也是潛在的生物戰(zhàn)劑。深入認識炭疽芽孢桿菌的感染與致病機制,有助于炭疽預防與治療新方法的發(fā)現(xiàn),對維護生物安全有重要意義。炭疽芽孢桿菌的毒力因子主要包括莢膜和毒素。炭疽毒素包含三種蛋白質成分:保護性抗原(PA),致死因子(LF)以及水腫因子(EF)。致死毒素(LT)由LF和PA構成,LF借助PA進入細胞,通過剪切絲裂原活化的蛋白激酶激酶(MAPKK)1-4、6和7而使相關通路失活。水腫毒素(ET)由EF與PA構成,EF借助PA進入細胞,能夠劇烈升高細胞內cAMP水平,影響機體相關信號轉導。以往對炭疽毒素的研究主要集中于LT,而對ET在炭疽感染和死亡中發(fā)揮的作用還不是十分了解。炭疽芽孢可以通過呼吸道、皮膚或消化道感染宿主。通過呼吸道進入體內的炭疽芽孢在被肺泡巨噬細胞吞噬后進入局部淋巴結,并萌發(fā)成繁殖體細菌。而在局部組織中萌發(fā)的炭疽芽孢,也能夠利用炭疽毒素破壞天然免疫屏障而進入到局部淋巴結。巨噬細胞是天然免疫系統(tǒng)的關鍵成員之一,本研究針對ET對巨噬細胞功能的抑制作用及其分子機制進行了研究。首先在大腸桿菌中表達并純化野生型炭疽水腫因子EF,及腺苷環(huán)化酶活性關鍵氨基酸殘基突變的EF(H351R)和EF(H351A)。在體外非細胞反應體系和CHO-k1細胞中,野生型EF表現(xiàn)出極高cAMP生成效率,而EF(H351R)和EF(H351A)催化產生c AMP的效率大幅降低但仍有殘留。在小鼠實驗中,野生型或突變體EF與PA構成的ET、ET(H351R)和ET(H351A)能造成不同程度的器官損傷和局部水腫,損傷嚴重程度與組織內cAMP水平正相關。25-50μg的野生型ET可以造成小鼠死亡,而相同劑量的ET(H351R)或ET(H351A)對小鼠沒有致死性。以小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7作為細胞模型,對ET的作用效果進行評價。單核細胞成熟后可以分化成組織駐留表型和炎性表型兩種不同的亞群。通過流式細胞術檢測RAW264.7表面分子標志顯示,在未經處理或LPS單獨處理時細胞呈現(xiàn)CD14~+CD16/32~+的組織駐留表型,而ET與LPS共同刺激后這些細胞轉變?yōu)镃D14~(hi)CD16/32~-的表型。表達GFP蛋白的大腸桿菌能夠被巨噬細胞吞噬,通過流式細胞術檢測巨噬細胞的GFP陽性率及每個細胞中GFP熒光強度,能夠反映巨噬細胞的吞噬功能和殺菌功能。結果顯示,經ET預處理3h后的巨噬細胞吞噬功能沒有下降,但是對胞內細菌的殺傷功能明顯減弱。而對巨噬細胞分泌的細胞因子檢測表明,ET處理下調了促炎細胞因子TNF-α和MCP-1的產生而上調了抑炎細胞因子IL-10和IL-6的產生。這些現(xiàn)象提示,ET處理使RAW264.7細胞向M2型分化。進一步利用新一代測序技術,對ET、ET(H351A)、腺苷酸環(huán)化酶激動劑Forskolin或PA處理后的RAW264.7細胞轉錄組進行了分析。相比PA處理組,ET、ET(H351A)和Forskolin處理分別使RAW264.7細胞產生了1228個、264個和211個基因表達上調或下調。對細胞內cAMP水平檢測的結果顯示cAMP水平升高與轉錄組差異程度具有正相關。從ET處理產生的差異基因篩選到了27個cAMP依賴基因,這些基因的功能主要與巨噬細胞免疫反應有關,而剩余的非cAMP依賴基因則主要參與細胞物質、能量代謝等功能。通過KEGG信號通路聚類分析ET處理產生的差異基因,發(fā)現(xiàn)TNF-α經過MAPK和NF-kB信號介導巨噬細胞活化這一途徑中有較多差異基因富集。通過western-blot檢測發(fā)現(xiàn),ET處理抑制了MAPK蛋白家族成員ERK的磷酸化活化。而ET和ERK磷酸化抑制劑PD3125901處理RAW264.7細胞均能抑制細胞中TNF-α的轉錄活化與分泌。這提示,ET下調巨噬細胞TNF-α產生可能與ERK磷酸化抑制有關。ET處理還能抑制NF-kB結合位報告基因的活化以及下調TNF-α對NF-kB的激活。NF-kB抑制劑BAY 11-7082也能下調TNF-α基因啟動子的活化。p65是最重要的NF-kB亞基。ET處理抑制了p65的磷酸化,減少了p65在細胞核中的定位。cAMP主要通過活化PKA發(fā)揮其活性。PKA抑制劑H89能夠逆轉ET對NF-kB轉錄活性的抑制。這些結果表明,ET可能通過PKA途徑抑制p65介導的TNF-α轉錄活化。以上結果表明,ET可以通過抑制ERK和NF-kB活化,減少巨噬細胞的TNF-α產生。綜上所述,本研究制備了野生型EF及其腺苷酸環(huán)化酶活性減弱的突變體EF(H351A)和EF(H351R),發(fā)現(xiàn)了ET對于巨噬細胞表面分子標記改變和促炎功能的抑制;通過轉錄組測序,揭示了ET對巨噬細胞免疫功能的調控主要與其腺苷酸環(huán)化酶活性相關;進一步的分子機制研究表明,ET可能通過PKA途徑抑制ERK和NF-kB活化,從而下調了巨噬細胞炎性因子TNF-α的產生。
【學位授予單位】：軍事科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R378
【圖文】：

圖 1 炭疽毒素作用模式圖[9]Figure1. Mode of action of anthrax toxins在炭疽感染中的作用根據(jù)炭疽芽孢進入宿主機體的途徑，炭疽病有三種形式：皮膚、胃腸道炭疽（圖 2）。早期研究表明定殖的巨噬細胞和樹突細胞將炭疽芽孢吞特洛伊木馬”一樣將芽孢從外周部位帶到局部淋巴結。炭疽芽孢在局部淋成能產生毒素的細菌繁殖體[10]。近年來，有實驗證明炭疽芽孢也能在鼻組織、腸相關淋巴組織或損傷的表皮軟組織中萌發(fā)，并開始產生毒力因素和蛋白酶。這些毒力因子能夠降低機體的免疫反應和增加組織通透性菌繁殖體進入到局部淋巴結，這種感染模式被稱為“越獄模型”[11]。一旦結被炭疽毒素“攻破”，炭疽芽孢桿菌便能夠隨血液循環(huán)，引起菌血癥，宿主死亡。

圖 2 炭疽芽孢通過三種途徑進入宿主[12]Figure 2.B. anthracis enters the host as a spore through threealternative ports對小鼠皮下注射重組表達的 ET 能造成嚴重的皮膚水腫，而全身攻毒則引起消化道液體聚集、肝水腫、嚴重組織損傷以及死亡[13,14]。對于小鼠，ET 的最低致死劑量是 20  30 μg，低于 LT 對小鼠的最低致死劑量（40  100 μg），這表明在炭疽芽孢桿菌致病過程中 ET 也發(fā)揮著重要的作用。除了在炭疽感染末期造成直接組織損傷以及引起死亡，ET 在炭疽感染初期能夠干擾宿主天然免疫反應，促進了全身感染的形成（圖 3）。在髓系細胞中特異性敲除 CMG2 的小鼠能夠耐受 Sterne 株炭疽芽孢及細菌繁殖體的攻毒，而野生型小鼠對這個菌株的攻毒高度敏感；另外，這些髓系細胞特異性敲除 CMG2 的小鼠對 LT 和 ET 攻毒的敏感性沒有下降[15]，表明炭疽毒素對炭疽芽孢桿菌躲避髓系細胞的清除作用至關重要。敲除 EF 基因的炭疽芽孢桿菌 Sterne 株感染力下降

第 5 頁圖 3 炭疽毒素對巨噬細胞作用[12]Figure3. Effects of the anthrax toxins on macrophages作用的分子機制ET 的主要活性是將 ATP 轉化為 cAMP，cAMP 是一種在細胞內廣泛存在的信使，其濃度改變能夠引發(fā)復雜的生物效應。但是我們對 ET 引發(fā)的機體損 cAMP 水平升高之間的具體機制還不是十分了解。cAMP 是二級信使家族最早的成員，大量研究表明，cAMP 對包括阿米巴蟲、和哺乳動物等多種生物的細胞功有調控作用[24]。這個二級信使分子介導的生程包括記憶、代謝、記憶調控和免疫功能[25]。細胞內的 cAMP 水平受到磷酸酶（phosphodiesterase，PDE）的嚴格調控，PDE 通過水解 cAMP 拮抗其信細胞內的 AC 與 PDE 通常定位于不同的空間結構，因而 cAMP 的產生與消

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本文編號：2793903