【摘要】：目的:瘧疾是由瘧原蟲引起的通過雌性按蚊傳播的感染性寄生蟲疾病,它嚴(yán)重威脅人類健康并給發(fā)展中國家?guī)韲?yán)重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),已成為全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。過去的十年中,在瘧疾的控制上有了重大進(jìn)展,然而對(duì)于一些瘧疾的高密度流行國家來說為實(shí)現(xiàn)徹底消除瘧疾這一目標(biāo),仍面臨許多技術(shù)難題。目前瘧疾控制措施在很大程度上依賴于有效的化療治療受感染的病人和病媒控制如經(jīng)殺蟲劑處理的蚊帳和室內(nèi)藥物的噴灑。然而,由于耐藥瘧原蟲和耐殺蟲劑蚊子的出現(xiàn),進(jìn)一步增加了瘧疾的有效防控的難度。國際瘧疾消除專家委員會(huì)(MalERA)認(rèn)為疫苗可以有效地阻斷瘧疾的傳播對(duì)于瘧疾的消除非常重要。目前瘧疾疫苗的研發(fā)主要針對(duì)有性發(fā)展階段的傳播阻斷疫苗(transmission-blocking vaccines,TBVs)。TBVs旨在誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)干擾瘧原蟲從人體傳播到蚊子,進(jìn)一步阻止疾病在人類之間傳播。TBVs候選抗原主要表達(dá)在蚊階段瘧原蟲表面,不受脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)選擇壓力的影響,顯示出較低的多態(tài)水平,不會(huì)出現(xiàn)抗原變異,更有利于疫苗的免疫效果,因此,被認(rèn)為是加速瘧疾控制和支持最終根除瘧疾的新策略。盡管如此,但TBVs的研發(fā)進(jìn)展依然遲緩,迄今為止只有Pfs25和Pvs25的傳播阻斷疫苗已經(jīng)達(dá)到臨床試驗(yàn)的第一階段,迫切需要篩選并增加新型瘧原蟲有性階段候選抗原,明確其分子結(jié)構(gòu)、表達(dá)階段、生物學(xué)功能及其免疫學(xué)特性,以便開發(fā)高效、安全的TBV疫苗。在TBV新型抗原的發(fā)現(xiàn)和基因功能的研究中,我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在瘧原蟲有性階段高度保守的基因。PBANKA_060330在嚙齒類動(dòng)物寄生蟲P.berghei被指定為Pbg37,它同時(shí)表達(dá)在受精前期和受精后期兩個(gè)階段。敲除這個(gè)基因主要影響了雄性配子的形成和功能。抗重組蛋白Pbg37(rPbg37)的血清在直接蚊子喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生了明顯的阻斷傳播活力。研究方法:1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、瘧原蟲及蚊子。6-8周齡BALB/c小鼠購買于北京動(dòng)物研究所。鼠瘧P.berghei ANKA株通過小鼠的傳代培養(yǎng)保存。小鼠感染由腹腔內(nèi)注射1×10~7個(gè)P.berghei感染的紅細(xì)胞(RBCs)。斯氏按蚊(Hor株)飼養(yǎng)在25°C恒溫、50-80%濕度的蚊蟲室里。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。2)重組蛋白的表達(dá)和純化。為表達(dá)重組Pbg37蛋白(rPbg37),我們?nèi)サ粜盘?hào)肽和跨膜區(qū),選取蛋白區(qū)域(26-88aa)設(shè)計(jì)引物。提取總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用引物pbg37-F和pbg37-R擴(kuò)增Pbg37片段。PCR產(chǎn)物及pET32a(+)載體經(jīng)過Not I和Bam HI消化后,將片段克隆到載體上。經(jīng)過雙酶切和測(cè)序鑒定正確后,將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta-gami B細(xì)胞(DE3)。經(jīng)1mM IPTG(isopropyl-D-1-thiogalactoside)于19°C誘導(dǎo)8 h,使用鎳氨三乙酸瓊脂糖柱Ni-NTA His·Bind Superflow(Novagen)進(jìn)行蛋白純化。pET32a空載體表達(dá)和純化的蛋白作為免疫動(dòng)物的陰性對(duì)照。純化的重組蛋白在4°C的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)中透析過夜,并用10%SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)。3)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫。6-8周齡BALB/c雌性小鼠5只(n=5),通過皮下注射重組蛋白rPbg37(50μg/鼠)與完全弗氏佐劑乳化產(chǎn)物。每隔兩周加強(qiáng)免疫一次rPbg37(25μg/鼠),共強(qiáng)化免疫兩次。另一組老鼠(n=5)應(yīng)用相同的免疫程序免疫陰性對(duì)照蛋白。于每次免疫的前一天與最后一次免疫后第14天,尾靜脈收集每只小鼠血液(100μl/只),室溫凝集后收集血清。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)rPbg37免疫血清的抗體滴度。酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處OD值。免疫血清抗體滴度終點(diǎn)的定義是光密度(OD)值在490 nm時(shí)實(shí)驗(yàn)組的平均值不大于對(duì)照組均值+3×標(biāo)準(zhǔn)差的抗血清的稀釋倍數(shù)。4)免疫印跡和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)。為了確定Pbg37蛋白的表達(dá)階段,使用Nycodenz梯度分別純化P.berghei的裂殖體、配子體、合子和動(dòng)合子,用含有蛋白酶抑制劑的2%SDS提取蛋白。等量的瘧原蟲蛋白質(zhì)(10μg)用10%SDS-PAGE凝膠分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Bio-Rad)。用抗rPbg37鼠血清(1:200)標(biāo)記PVDF膜,用ECL發(fā)光方法在熒光圖像分析系統(tǒng)中檢測(cè)。純化的瘧原蟲用抗rPbg37鼠血清(以3%BSA/PBS稀釋至1:200)標(biāo)記。用10μl DAPI染核10分鐘后經(jīng)抗淬滅封片劑ProLong?Gold antifade reagent封片,在奧林巴斯BX53熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。Pbs21單克隆抗體染動(dòng)合子用作陽性對(duì)照。對(duì)照蛋白免疫血清作為陰性對(duì)照。5)基因敲除�；蚯贸捎秒p交叉同源重組方法得到pbg37基因敲除株(Δpbg37)。pbg37 5′和3′同源臂分別使用5UTR-F×5UTR-R和3UTR-F×3UTR-R擴(kuò)增,克隆至含有人dhfr耐藥基因的載體PL0034中。10μg質(zhì)粒用Hind III和Xho I線性化后使用Nucleofactor?電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)染至純化的P.berghei裂殖體。轉(zhuǎn)染后的瘧原蟲和50μl完全培養(yǎng)基尾靜脈打給小鼠。二十四小時(shí)后,小鼠的飲用水中加入乙胺嘧啶(70μg/毫升)篩選轉(zhuǎn)染成功的瘧原蟲。篩選后的瘧原蟲通過PCR方法進(jìn)行鑒定。當(dāng)小鼠的感染率達(dá)到3%時(shí),尾靜脈取血100μl提取基因組DNA,通過引物P1×P2、P1×P3及P4×P5進(jìn)行內(nèi)源性PCR確認(rèn)pbg37基因敲除。6)Δpbg37型瘧原蟲的表型分析。為了研究pbg37基因敲除后對(duì)瘧原蟲生長(zhǎng)的影響,6-8周齡的雌性BALB/c小鼠,每組5只,腹腔注射1×10~6Δpbg37感染的紅細(xì)胞(克隆KO1和KO2),或相同數(shù)量的野生型P.berghei感染的紅細(xì)胞。感染后第3天開始每天制備血涂片,經(jīng)吉姆薩染色后顯微鏡下觀察瘧原蟲形態(tài)、瘧疾血癥、配子體率及配子體比率。配子體比率是100個(gè)配子體中分化成雌雄配子體的性別比例。成熟的配子體率是在100個(gè)配子體中成熟的配子體所占的比例。計(jì)數(shù)雄性配子體的出絲和動(dòng)合子的形成使用體外培養(yǎng)的方法。取含有相同數(shù)量的成熟雄性配子體的感染血液與動(dòng)合子培養(yǎng)基混合,25°C下孵育15分鐘產(chǎn)生配子,出絲視野的計(jì)數(shù)在100X光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行,每只鼠計(jì)數(shù)二十個(gè)視野。為了觀察動(dòng)合子形成,上述孵育的血液繼續(xù)在19°C下孵育24 h,單克隆抗體Pbs21用來標(biāo)記動(dòng)合子,熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)。瘧原蟲感染蚊子的能力通過直接蚊子飼養(yǎng)試驗(yàn)來評(píng)估。小鼠感染后的第三天瘧疾血癥達(dá)到5-7%,經(jīng)饑餓12 h的成熟雌性按蚊吸食血液1 h。去除未吸血的按蚊,吸血后的蚊子飼養(yǎng)12天后取30只蚊子解剖,取出蚊中腸用0.5%汞溴紅藥水染色10分鐘,計(jì)數(shù)蚊子感染率(受感染的蚊子的數(shù)量/總數(shù)量的蚊子)和陽性蚊中腸的卵囊數(shù)。7)傳播阻斷能力的評(píng)估。Pbg37的傳播阻斷能力的評(píng)估分別使用體外動(dòng)合子形成試驗(yàn)和直接蚊子飼養(yǎng)試驗(yàn)。體外動(dòng)合子形成試驗(yàn)將小鼠腹腔內(nèi)注射1×10~6個(gè)P.berghei感染的紅細(xì)胞。在感染后的第3天,將動(dòng)合子培養(yǎng)基稀釋的1:5、1:10和1:50的抗rPbg37鼠血清或陰性對(duì)照血清與10μl感染小鼠的血液混合,總體積達(dá)到50μl。25°C下孵育15分鐘計(jì)數(shù)雄性配子體出絲視野,繼續(xù)19°C下孵育24 h計(jì)數(shù)動(dòng)合子形成數(shù)量。蚊子喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)將小鼠免疫rPbg37或陰性對(duì)照蛋白,在第3次免疫后的第14天,給免疫的小鼠腹腔注射感染1×10~6個(gè)P.berghei瘧原蟲。感染后第3天,每只小鼠喂養(yǎng)至少50只饑餓24h的成熟斯式按蚊,吸血后10天計(jì)數(shù)蚊子感染率和卵囊密度。8)統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS軟件,版本23.0(SPSS Inc.,美國)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的瘧疾血癥、配子體率、配子體性別比率、雄性配子體出絲數(shù)量及動(dòng)合子數(shù)量使用Student’s t檢驗(yàn)分析。卵囊密度采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)來分析,卡方檢驗(yàn)用來分析感染率。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)的方法表示。P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1)Pbg37是在瘧原蟲有性階段表達(dá)的高度保守蛋白。在瘧原蟲基因庫PlasmoDB中,我們通過以下條件篩選(1)在瘧原蟲種屬中高度保守的蛋白;(2)存在一個(gè)信號(hào)肽;(3)預(yù)測(cè)一個(gè)或多個(gè)跨膜區(qū)域和(4)主要表達(dá)在配子體階段。在瘧原蟲基因庫中RNA轉(zhuǎn)錄水平在配子體階段大于等于97%的有13個(gè)基因。其中,我們選擇PBANKA_060330做詳細(xì)的功能研究。該基因編碼349個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白分子量為40 kDa。SMART分析預(yù)測(cè)該蛋白包含一個(gè)假定的信號(hào)肽,七個(gè)跨膜區(qū)域和一個(gè)低復(fù)雜度區(qū)。BLAST多重序列比對(duì)的結(jié)果顯示該基因與除瘧原蟲以外的生物群體無同源性,且在瘧原蟲種屬中高度保守。由于該基因主要表達(dá)在P.berghei的配子體階段,去除信號(hào)肽后預(yù)測(cè)的成熟蛋白的大小~37 kDa,我們給該蛋白命名Pbg37。2)rPbg37免疫小鼠后血清抗體滴度的檢測(cè)。由于Pbg37預(yù)測(cè)有一個(gè)信號(hào)肽和多個(gè)跨膜域,我們?cè)谛盘?hào)肽和第一個(gè)跨膜區(qū)之間選擇63個(gè)氨基酸的片段(26-88個(gè)氨基酸)用于原核蛋白表達(dá)。Pbg37包含12個(gè)內(nèi)含子,RT-PCR用于擴(kuò)增表達(dá)的片段。含有His標(biāo)簽的rPbg37使用Ni-NTA親和層析純化,SDS-PAGE凝膠檢測(cè)到一個(gè)分子量約為27.9 kDa(包含His標(biāo)簽)大小的條帶,與蛋白預(yù)測(cè)的大小相符。rPbg37蛋白免疫小鼠后產(chǎn)生的多克隆抗體,通過ELISA方法檢測(cè)抗體滴度。結(jié)果顯示,第二次加強(qiáng)免疫產(chǎn)生的抗體滴度顯著高于對(duì)照組,在最后一次免疫結(jié)束10天后抗體滴度達(dá)到1:64000。這個(gè)結(jié)果表明,rPbg37蛋白具有較高的免疫原性。3)Pbg37表達(dá)階段的確定。為了確定Pbg37蛋白的表達(dá)階段,等量的裂殖體、配子體、合子和動(dòng)合子的溶解產(chǎn)物使用SDS-PAGE凝膠分離后,用抗rPbg37的鼠血清做免疫印跡。在配子體、合子和動(dòng)合子的裂解產(chǎn)物上識(shí)別出一條大小約為~37 kDa的條帶,而未在裂殖體裂解產(chǎn)物上發(fā)現(xiàn)特定條帶,這與之前預(yù)測(cè)的Pbg37主要表達(dá)在有性階段相符合,且分子量的大小也與預(yù)測(cè)的Pbg37成熟蛋白大小相符合。rHSP70蛋白免疫的血清作為陽性對(duì)照用來檢測(cè)各泳道蛋白量是否相等,Pbg37在動(dòng)合子上的條帶略淺,表明Pbg37在動(dòng)合子上表達(dá)較低。對(duì)照蛋白免疫的血清作為陰性對(duì)照均未檢測(cè)到條帶。由于預(yù)測(cè)的蛋白包含信號(hào)肽和跨膜區(qū),我們想要確定Pbg37在瘧原蟲有性發(fā)展階段的定位。IFA結(jié)果顯示,Pbg37在裂殖體上不表達(dá),且在配子體的表達(dá)上存在性別差異,既Pbg37在雄性配子體上表達(dá)高于雌性配子體。雄配子體出絲后Pbg37主要表達(dá)在殘余體上,小配子上也能觀察到熒光斑點(diǎn),相比之下,大配子上具有較弱的熒光且在蟲體表面參差不齊。合子表面有較強(qiáng)熒光強(qiáng)度,在向動(dòng)合子轉(zhuǎn)換階段熒光信號(hào)逐漸下降。在不透膜的情況下只在配子及以后的階段有表達(dá),透膜后在配子體及以后的階段均有表達(dá),表明Pbg37的N端結(jié)構(gòu)域是定位在瘧原蟲膜外的。對(duì)照組的血清在瘧原蟲的這些發(fā)展階段均未檢測(cè)到熒光信號(hào)。4)Pbg37對(duì)瘧原蟲有性階段尤其是雄性配子體的發(fā)展至關(guān)重要。為了確定Pbg37在P.berghei各發(fā)育階段的功能,我們使用雙交叉同源重組的方法獲得了Pbg37敲除株(Δpbg37)。轉(zhuǎn)染后經(jīng)乙嘧啶篩選,得到的耐藥型瘧原蟲通過內(nèi)源性PCR鑒定。以野生型作為對(duì)照分析Δpbg37(克隆KO1和KO2)的表型,Δpbg37的瘧疾血癥與野生型相比無顯著差異,這可能由于Pbg37在無性階段不表達(dá)。然而,Δpbg37與野生型相比顯示較低的配子體率。感染后第3天配子體率達(dá)到峰值時(shí),Δpbg37配子體率與野生型相比減少60%。此外,敲除了pbg37后顯著影響了配子體的性別比例,Δpbg37雌雄配子體的比例(~6:1)顯著高于野生型(~3:1)。在吉姆薩染色的薄血片中觀察到,Δpbg37雄性和雌性配子體的形態(tài)與野生型不同,敲除了pbg37后雄性配子體的發(fā)展和成熟均受到影響。在感染后第三天,Δpbg37成熟的雄性配子體比例顯著低于野生型組,而成熟的雌配子體的比例沒有顯著差異。此外,即使成熟的雄性配子體形態(tài)正常,在出絲方面也表現(xiàn)出缺陷。體外出絲實(shí)驗(yàn),Δpbg37和野生型使用相同數(shù)量的成熟的雄性配子體,Δpbg37的出絲視野比野生型減少~36%。綜上,這些表型分析結(jié)果顯示,Δpbg37主要影響雄性配子體的發(fā)育和成熟。我們進(jìn)一步研究了敲除pbg37后對(duì)體外受精及之后發(fā)育階段的影響。在體外動(dòng)合子培養(yǎng)過程中,Δpbg37和野生型使用相同數(shù)量的成熟雄性配子體培養(yǎng),Δpbg37顯示動(dòng)合子數(shù)減少~75%,而合子和Retort的數(shù)量與野生型相比差異不大。Δpbg37和野生型感染的小鼠同時(shí)飼養(yǎng)蚊子,Δpbg37顯示顯著減少的感染率和卵囊密度。Δpbg37組蚊子感染率為68.2%遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于野生型組(93.1%),卵囊密度由野生型組平均每個(gè)蚊中腸140.9個(gè)下降到Δpbg37組平均每個(gè)蚊中腸12.2個(gè),平均減少了91.4%。5)抗rPbg37的血清具有明顯的傳播阻斷能力。我們分別使用體外動(dòng)合子形成和直接蚊子喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步確定瘧原蟲有性階段表達(dá)的蛋白Pbg37的傳播阻斷活性。抗rPbg37的血清在1:5、1:10和1:50稀釋的情況下對(duì)雄性配子體出絲的阻斷能力分別為70%、65%和60%,對(duì)動(dòng)合子形成的阻斷能力分別為71%、58%和52%。為了確定Pbg37體內(nèi)傳播阻斷能力,rPbg37免疫的小鼠在最后一次免疫后14天直接喂養(yǎng)蚊子。與對(duì)照蛋白免疫組相比,rPbg37免疫組顯示輕微下降的蚊子感染率(9.23%),且卵囊密度減少了49.1%。結(jié)論:1)Pbg37編碼的蛋白分子量大小為37 kDa,含有一個(gè)信號(hào)肽、七個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)低度復(fù)雜區(qū)。2)Pbg37主要表達(dá)在配子體階段。3)Pbg37對(duì)瘧原蟲有性階段尤其是雄性配子體的生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要。Pbg37敲除后與野生型瘧原蟲相比,顯示較低的配子體率,較高的雌雄配子體比例和較低的成熟雄性配子體比例,在使用相同的成熟雄性配子體做體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí),Δpbg37的出絲視野數(shù)量及動(dòng)合子數(shù)量均顯著下降。4)抗rPbg37的血清有明顯的傳播阻斷能力。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R382.31
【圖文】：

3 結(jié)果3.1 Pbg37 的生物信息學(xué)分析Pbg37（PBANKA_060330）在瘧原蟲數(shù)據(jù)庫（PlasmoDB）中被描述為“保守的瘧原蟲蛋白，功能未知”。Pbqsox 位于 6 號(hào)染色體 188,330 到 190,769 之間，蛋白長(zhǎng)度為 349 aa，蛋白分子量為 40207 Da。對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)域分析顯示，Pbg37蛋白含有一個(gè)信號(hào)肽，七個(gè)跨膜區(qū)及一個(gè)低度復(fù)雜區(qū)（圖 1）。對(duì) pbg37 進(jìn)行BLAST 分析后顯示該基因在瘧原蟲種屬中高度同源（圖 2）。圖 1. Pbg37 的蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)圖

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3 結(jié)果3.1 Pbg37 的生物信息學(xué)分析Pbg37（PBANKA_060330）在瘧原蟲數(shù)據(jù)庫（PlasmoDB）中被描述為“保守的瘧原蟲蛋白，功能未知”。Pbqsox 位于 6 號(hào)染色體 188,330 到 190,769 之間，蛋白長(zhǎng)度為 349 aa，蛋白分子量為 40207 Da。對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)域分析顯示，Pbg37蛋白含有一個(gè)信號(hào)肽，七個(gè)跨膜區(qū)及一個(gè)低度復(fù)雜區(qū)（圖 1）。對(duì) pbg37 進(jìn)行BLAST 分析后顯示該基因在瘧原蟲種屬中高度同源（圖 2）。

圖 3. Pbg37 原核表達(dá)載體構(gòu)建模式圖。37 蛋白表達(dá)與純化（+）- Pbg37 表達(dá)載體經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)，菌體超聲破碎后，在上 27.9 kDa 的蛋白條帶，證明 rPbQSOX 重組蛋白主要以可溶形式g 鎳氨三乙酸瓊脂糖柱純化重組蛋白，并對(duì)洗脫及透析后的樣電泳檢測(cè)，可清晰看到目標(biāo)蛋白條帶，其蛋白純度>85%，濃度圖 4）。

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9 劉婧宏;王s

本文編號(hào)：2793686