【摘要】：腸道病毒 71 型(Enterovirus 71,EV71)是手足口病(hand-foot-and-mouthdisease,HFMD)的主要病原體,其感染所引起的臨床癥狀與柯薩奇病毒A16(CoxsakieA16)感染所引起的手足口病難以區(qū)分,但是EV71的臨床指證有其獨有的特點,它還能引起多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病。近年來,手足口病的發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)在我國呈大幅上升趨勢,此病的流行對于我國的社會安定形成了一定的威脅,也是對我國醫(yī)療防控體系的挑戰(zhàn)。目前,手足口病仍然缺乏有針對性的抗病毒藥物,EV71的致病機制不清成為主要的制約因素。所以對于EV71的致病機制,尤其是對宿主的功能影響的基礎(chǔ)研究至關(guān)重要。細胞感染EV71病毒之后,就會進入病變過程直至死亡。細胞將經(jīng)歷形態(tài)學以及細胞學的變化。這種變化通常伴隨著細胞的生理和病理變化,會影響宿主細胞的穩(wěn)態(tài),并伴隨有細胞內(nèi)各種細胞器的功能障礙。其中本課題組以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EV71感染的細胞中線粒體的形態(tài)和功能發(fā)生了明顯改變。線粒體是一種多任務(wù)細胞器,它對于細胞產(chǎn)生ATP、新陳代謝、程序性細胞死亡都有非常重要的作用,是維持細胞功能的重要的細胞器。線粒體損傷主要是指在活性氧簇(ROS)、營養(yǎng)缺乏、細胞衰老、病原體感染等刺激下,細胞內(nèi)的線粒體發(fā)生去極化損傷,最突出的表現(xiàn)就是線粒體動力學改變,導致線粒體融合和分裂平衡的紊亂。EV71導致的線粒體損傷具有何種特點,通過何種機制引起線粒體損傷并不完全清楚。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上,對EV71感染細胞中線粒體的動力學進行了檢測,發(fā)現(xiàn)在EV71感染細胞中,線粒體的融合減弱,分裂增強。通過對調(diào)控線粒體動力學的相關(guān)分子進行檢測,發(fā)現(xiàn)INF2在EV71感染的細胞中被裂解。INF2是一個特殊的Formin分子,其同時參與actin的聚合和解聚過程,并可以在Drpl上游,通過招募Drpl參與線粒體的分裂過程。進一步的研究發(fā)現(xiàn)EV71是通過其2A蛋白酶對INF2產(chǎn)生裂解,裂解的位點位于1050-1054位氨基酸。此外,我們的研究還發(fā)現(xiàn)在EV71感染的細胞中,復制復合體周圍的INF2信號減弱,提示INF2的裂解有利于復制復合體的形成。本研究初步揭示了 EV71引起線粒體動力學改變的機制,為EV71的致病機制的闡明提供新的提示。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R373.2
【圖文】：

粒體對鈣離子的攝取，造成線粒體內(nèi)膜的收縮以及促進線粒體分裂。逡逑ＥＶ７１是通過何種機制影響線粒體的動力學特征以及這種影響對其自身的生物學逡逑意義值得我們思考。ＥＶ７１的復制生活周期以及病毒蛋白表達具有自己獨特的方式。逡逑ＥＶ７１通過自身僅有的一個開放閱讀框（ＯＲＦ）編碼總長度為２１９４個氨基酸的前體蛋逡逑白，該前體蛋白經(jīng)過一系列的加工機制最終形成成熟的病毒蛋白。具體來講，ＥＶ７１逡逑通過自身表達的２Ａｐｒｅ和３ＣＰ？進行加工，將病毒的前體蛋白裂解為ＰＩ、Ｐ２和Ｐ３這三逡逑個蛋白前體，其中的Ｐ１蛋白可以進一步被加工成ＥＶ７１的四個結(jié)構(gòu)蛋白，分別為ＶＰ１、逡逑ＶＰ２、ＶＰ３和ＶＰ４。Ｐ２蛋白可以進一步被加工成２Ａ和２ＢＣ，２ＢＣ再次被進一步加工逡逑成２Ｂ和２Ｃ。Ｐ３蛋白可以進一步被加工成３ＡＢ和３ＣＤ，二者再一次被進一步加工成逡逑３Ａ、３Ｂ、３Ｃ和３Ｄ［７４］。在ＥＶ７１感染細胞的過程中，病毒編碼的２Ａｐｒｏ和３ＣＰ？不僅可逡逑以參與自身病毒蛋白的加工成熟，還可以作用于多種宿主蛋白，從而促進自身的復制逡逑和進行免疫逃逸。逡逑５＊邋ＵＴＲ

實驗結(jié)果逡逑一、ＥＶ７１感染導致線粒體形態(tài)發(fā)生異常逡逑本課題組的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ＥＶ７１感染細胞中，線粒體的形態(tài)和功能發(fā)逡逑生異常。為了進一步研究ＥＶ７１對線粒體的影響，我們在ＲＤ細胞中轉(zhuǎn)染了定逡逑位于線粒體的紅色熒光蛋白（Ｍｉｔｏ－ｄｓＲｅｄ），以ＥＶ７１感染轉(zhuǎn)染后細胞，通過逡逑激光共聚焦顯微鏡觀測線粒體的改變。實驗結(jié)果顯示，與未感染組相比，線逡逑粒體發(fā)生了明顯改變，其在細胞內(nèi)的絲狀分布變?yōu)辄c狀分布，說明線粒體的逡逑動力學發(fā)生了改變，融合減弱而分裂增強（圖３）。逡逑Ｍｏｃｋ邐ＥＶ７１逡逑

ＥＶ７１感染細胞中ＩＮＦ２發(fā)生裂解。ＲＤ細胞感染ＥＶ７１邋（ＭＯＩ＝小時Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測ＩＮＦ２的表達。逡逑７１的２ＡＰ？參與對ＩＮＦ２分子的裂解逡逑ＥＶ７１基因組僅有一個開放閱讀框（０ＲＦ），這個０ＲＦ２１９４個氨基酸的前體蛋白，該前體蛋白通過自身基因編Ｐ？進行加工裂解為ＥＶ７１的四個結(jié)構(gòu)蛋白和七個非結(jié)構(gòu)如上所述，在ＥＶ７１感染細胞的過程中，病毒編碼的２于多種宿主蛋白，從而促進自身的復制和進行免疫逃逸。的２Ａｐｒｏ和３ＣＰ？是否是導致ＩＮＦ２裂解的原因，我們在Ｂ達了邋ＥＶ７１的２ＡＰ？和３ＣＰ？，通過＼＼咖￡１１：＾１0１檢測病毒蛋影響。結(jié)果顯示ＥＶ７１的２ＡＰ？可以導致ＩＮＦ２的裂解，解條帶，該裂解條帶的強度隨２Ａ表達量的增加而增加。

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本文編號：2791280