【摘要】：腸道病毒 71 型(Enterovirus 71,EV71)是手足口病(hand-foot-and-mouthdisease,HFMD)的主要病原體,其感染所引起的臨床癥狀與柯薩奇病毒A16(CoxsakieA16)感染所引起的手足口病難以區(qū)分,但是EV71的臨床指證有其獨(dú)有的特點(diǎn),它還能引起多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病。近年來(lái),手足口病的發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)在我國(guó)呈大幅上升趨勢(shì),此病的流行對(duì)于我國(guó)的社會(huì)安定形成了一定的威脅,也是對(duì)我國(guó)醫(yī)療防控體系的挑戰(zhàn)。目前,手足口病仍然缺乏有針對(duì)性的抗病毒藥物,EV71的致病機(jī)制不清成為主要的制約因素。所以對(duì)于EV71的致病機(jī)制,尤其是對(duì)宿主的功能影響的基礎(chǔ)研究至關(guān)重要。細(xì)胞感染EV71病毒之后,就會(huì)進(jìn)入病變過(guò)程直至死亡。細(xì)胞將經(jīng)歷形態(tài)學(xué)以及細(xì)胞學(xué)的變化。這種變化通常伴隨著細(xì)胞的生理和病理變化,會(huì)影響宿主細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),并伴隨有細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器的功能障礙。其中本課題組以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EV71感染的細(xì)胞中線粒體的形態(tài)和功能發(fā)生了明顯改變。線粒體是一種多任務(wù)細(xì)胞器,它對(duì)于細(xì)胞產(chǎn)生ATP、新陳代謝、程序性細(xì)胞死亡都有非常重要的作用,是維持細(xì)胞功能的重要的細(xì)胞器。線粒體損傷主要是指在活性氧簇(ROS)、營(yíng)養(yǎng)缺乏、細(xì)胞衰老、病原體感染等刺激下,細(xì)胞內(nèi)的線粒體發(fā)生去極化損傷,最突出的表現(xiàn)就是線粒體動(dòng)力學(xué)改變,導(dǎo)致線粒體融合和分裂平衡的紊亂。EV71導(dǎo)致的線粒體損傷具有何種特點(diǎn),通過(guò)何種機(jī)制引起線粒體損傷并不完全清楚。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上,對(duì)EV71感染細(xì)胞中線粒體的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在EV71感染細(xì)胞中,線粒體的融合減弱,分裂增強(qiáng)。通過(guò)對(duì)調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)的相關(guān)分子進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)INF2在EV71感染的細(xì)胞中被裂解。INF2是一個(gè)特殊的Formin分子,其同時(shí)參與actin的聚合和解聚過(guò)程,并可以在Drpl上游,通過(guò)招募Drpl參與線粒體的分裂過(guò)程。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)EV71是通過(guò)其2A蛋白酶對(duì)INF2產(chǎn)生裂解,裂解的位點(diǎn)位于1050-1054位氨基酸。此外,我們的研究還發(fā)現(xiàn)在EV71感染的細(xì)胞中,復(fù)制復(fù)合體周?chē)腎NF2信號(hào)減弱,提示INF2的裂解有利于復(fù)制復(fù)合體的形成。本研究初步揭示了 EV71引起線粒體動(dòng)力學(xué)改變的機(jī)制,為EV71的致病機(jī)制的闡明提供新的提示。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R373.2
【圖文】：

粒體對(duì)鈣離子的攝取，造成線粒體內(nèi)膜的收縮以及促進(jìn)線粒體分裂。逡逑ＥＶ７１是通過(guò)何種機(jī)制影響線粒體的動(dòng)力學(xué)特征以及這種影響對(duì)其自身的生物學(xué)逡逑意義值得我們思考。ＥＶ７１的復(fù)制生活周期以及病毒蛋白表達(dá)具有自己獨(dú)特的方式。逡逑ＥＶ７１通過(guò)自身僅有的一個(gè)開(kāi)放閱讀框（ＯＲＦ）編碼總長(zhǎng)度為２１９４個(gè)氨基酸的前體蛋逡逑白，該前體蛋白經(jīng)過(guò)一系列的加工機(jī)制最終形成成熟的病毒蛋白。具體來(lái)講，ＥＶ７１逡逑通過(guò)自身表達(dá)的２Ａｐｒｅ和３ＣＰ？進(jìn)行加工，將病毒的前體蛋白裂解為ＰＩ、Ｐ２和Ｐ３這三逡逑個(gè)蛋白前體，其中的Ｐ１蛋白可以進(jìn)一步被加工成ＥＶ７１的四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，分別為ＶＰ１、逡逑ＶＰ２、ＶＰ３和ＶＰ４。Ｐ２蛋白可以進(jìn)一步被加工成２Ａ和２ＢＣ，２ＢＣ再次被進(jìn)一步加工逡逑成２Ｂ和２Ｃ。Ｐ３蛋白可以進(jìn)一步被加工成３ＡＢ和３ＣＤ，二者再一次被進(jìn)一步加工成逡逑３Ａ、３Ｂ、３Ｃ和３Ｄ［７４］。在ＥＶ７１感染細(xì)胞的過(guò)程中，病毒編碼的２Ａｐｒｏ和３ＣＰ？不僅可逡逑以參與自身病毒蛋白的加工成熟，還可以作用于多種宿主蛋白，從而促進(jìn)自身的復(fù)制逡逑和進(jìn)行免疫逃逸。逡逑５＊邋ＵＴＲ

實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑一、ＥＶ７１感染導(dǎo)致線粒體形態(tài)發(fā)生異常逡逑本課題組的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ＥＶ７１感染細(xì)胞中，線粒體的形態(tài)和功能發(fā)逡逑生異常。為了進(jìn)一步研究ＥＶ７１對(duì)線粒體的影響，我們?cè)冢遥募?xì)胞中轉(zhuǎn)染了定逡逑位于線粒體的紅色熒光蛋白（Ｍｉｔｏ－ｄｓＲｅｄ），以ＥＶ７１感染轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，通過(guò)逡逑激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)線粒體的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未感染組相比，線逡逑粒體發(fā)生了明顯改變，其在細(xì)胞內(nèi)的絲狀分布變?yōu)辄c(diǎn)狀分布，說(shuō)明線粒體的逡逑動(dòng)力學(xué)發(fā)生了改變，融合減弱而分裂增強(qiáng)（圖３）。逡逑Ｍｏｃｋ邐ＥＶ７１逡逑

ＥＶ７１感染細(xì)胞中ＩＮＦ２發(fā)生裂解。ＲＤ細(xì)胞感染ＥＶ７１邋（ＭＯＩ＝小時(shí)Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測(cè)ＩＮＦ２的表達(dá)。逡逑７１的２ＡＰ？參與對(duì)ＩＮＦ２分子的裂解逡逑ＥＶ７１基因組僅有一個(gè)開(kāi)放閱讀框（０ＲＦ），這個(gè)０ＲＦ２１９４個(gè)氨基酸的前體蛋白，該前體蛋白通過(guò)自身基因編Ｐ？進(jìn)行加工裂解為ＥＶ７１的四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和七個(gè)非結(jié)構(gòu)如上所述，在ＥＶ７１感染細(xì)胞的過(guò)程中，病毒編碼的２于多種宿主蛋白，從而促進(jìn)自身的復(fù)制和進(jìn)行免疫逃逸。的２Ａｐｒｏ和３ＣＰ？是否是導(dǎo)致ＩＮＦ２裂解的原因，我們?cè)冢逻_(dá)了邋ＥＶ７１的２ＡＰ？和３ＣＰ？，通過(guò)＼＼咖￡１１：＾１0１檢測(cè)病毒蛋影響。結(jié)果顯示ＥＶ７１的２ＡＰ？可以導(dǎo)致ＩＮＦ２的裂解，解條帶，該裂解條帶的強(qiáng)度隨２Ａ表達(dá)量的增加而增加。

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本文編號(hào)：2791280