【摘要】：布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人畜共患病,可造成家畜的流產(chǎn)甚至人類波狀熱、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等。目前動物布魯氏菌疫苗主要為弱毒疫苗,但這類疫苗存在毒力較強容易導(dǎo)致流產(chǎn)且保護力較低的缺點。鑒于腦膜炎奈瑟菌外膜囊泡(OMVs)疫苗的成功研制,本項目對布魯氏菌OMVs的制備方法進行探索,并在小鼠模型上對OMVs及其組分的免疫原性和免疫保護性進行評價,為布魯氏菌新型亞單位疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。目的:(1)以羊種布魯氏菌新疆流行株043為研究對象,對提取的OMVs的形態(tài)和組分進行鑒定,探究其對巨噬細胞細胞因子表達和粘附內(nèi)化的影響。(2)建立與OMVs相關(guān)的外膜總蛋白(OMP)、重組外膜蛋白和脂多糖核心蛋白血清學(xué)評價方法,篩選獲得具有較強特異性和反應(yīng)原性的蛋白。(3)分析布魯氏菌外膜囊泡及其相關(guān)蛋白的免疫原性及免疫保護作用。方法:(1)通過超高速離心提取OMVs,使用透射電鏡觀察其形態(tài)和大小,利用SDS-PAGE鑒定OMVs的蛋白組成,通過RT-PCR檢測OMVs刺激小鼠巨噬細胞后細胞因子的表達,并通過CFU計數(shù)評價其對細胞粘附內(nèi)化的影響。(2)對OMP進行提取并表達和純化BP26、OMP10、GMD、ManB蛋白,通過Western Blot驗證其反應(yīng)原性,通過間接ELISA篩選特異性和反應(yīng)原性高的優(yōu)勢蛋白。(3)分別使用弗氏佐劑和納米佐劑(LDH)乳化OMVs、OMP、BP26、OMP10及BP26+OMP10雙抗原免疫小鼠,通過間接ELISA檢測其特異性抗體水平,通過流式細胞術(shù)檢測T淋巴細胞亞型以及通過ELISA檢測IFN-γ和IL-4的表達水平評價其細胞免疫水平。小鼠加強免疫14天后使用布魯氏菌M5株以2×10~6CFU進行攻毒實驗,攻毒15天后進行組織病理學(xué)觀察和脾臟載菌量的檢測,評價其免疫保護力。結(jié)果:(1)布魯氏菌043 OMVs大小在20-200nm之間,平均60.5nm,其蛋白組成主要為22、29、51KD左右;OMVs可顯著性誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞產(chǎn)生的IFN-γ、IL-6、IL-12、TNF-α和IL-10基因的轉(zhuǎn)錄表達,且IFN-γ、IL-6表現(xiàn)為早期表達。且OMVs可顯著增強細胞對布魯氏菌的粘附和內(nèi)化作用。(2)成功獲得了布魯氏菌OMP和BP26、OMP10、GMD、ManB蛋白,通過方陣滴定法建立了不同抗原的最佳ELISA反應(yīng)條件,并篩選得到了反應(yīng)原性較好的布魯氏菌OMVs、OMP、BP26、OMP10。(3)免疫實驗結(jié)果顯示:實驗動物可產(chǎn)生特異性抗體,且在初次21天時達到最高水平,復(fù)免后抗體明顯升高。弗氏佐劑和納米佐劑免疫組的脾臟淋巴細胞中均可檢測到高水平的IFN-γ,但IL-4的水平與PBS組無顯著差異,表明OMVs和及其相關(guān)蛋白均可誘導(dǎo)較強的Th1型免疫應(yīng)答。淋巴細胞亞群檢測結(jié)果顯示:各組抗原均能誘導(dǎo)非特異性T淋巴細胞增殖作用,而相對于OMP、BP26和OMP10,在納米佐劑作用下,OMVs很好的誘導(dǎo)了細胞免疫,促進了CD4+T細胞表達,誘導(dǎo)更強的Th1型免疫反應(yīng)應(yīng)答。布魯氏菌感染免疫后小鼠均能引起脾、肝、肺和腎不同程度的病理變化,納米佐劑組中OMVs和BP26有輕微病理變化,其他試驗組病變較明顯且嚴(yán)重。費氏佐劑組中OMP10和OMVs病變較輕。攻毒實驗結(jié)果顯示:納米佐劑組中OMVs脾指數(shù)最低,與未免疫組相比差異極顯著(p0.01),同時脾臟載菌量與未免疫組差異極顯著(p0.01);弗氏佐劑組中OMP10脾指數(shù)和CFU計數(shù)最低,較未免疫差異極顯著(p0.01)。結(jié)論:(1)成功建立了羊種布魯氏菌OMVs的提取方法,并鑒定了其形態(tài)和大小。(2)羊種布魯氏菌OMVs可誘導(dǎo)RAW264.7細胞產(chǎn)生強烈的Th1型免疫應(yīng)答,并促進RAW264.7細胞對細菌的粘附和內(nèi)化。(3)建立并優(yōu)化了血清學(xué)評價的間接ELISA方法,并篩選了具有特異性且反應(yīng)原性較好的免疫優(yōu)勢抗原。(4)小鼠免疫接種和攻毒試驗證實了OMVs的免疫原性和保護作用,以及納米佐劑對OMVs具有較高的免疫增強作用。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392
【圖文】：

性菌和古細菌也會產(chǎn)生 OMVs。關(guān)于外膜囊泡大量的研究發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)能。有趣的是，OMVs 作為一種潛在的疫苗抗原和佐劑可以用于預(yù)防的感染。Vs 產(chǎn)生及類型Vs 的產(chǎn)生在在培養(yǎng)基中生長的細菌可產(chǎn)生 OMVs，而且在體外感染的細胞內(nèi)或物的組織的生物膜上也已經(jīng)觀察到 OMVs 的產(chǎn)生。OMVs 是革蘭氏陰泌的產(chǎn)物，是細菌外膜以出芽的方式釋放并在表面形成的一種囊泡為球形，直徑大約在 20 250 nm 之間[57]。有研究稱一些革蘭氏陽性類似的囊泡[58,59]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有革蘭氏陰性菌都可以產(chǎn)生構(gòu)組成成分除外膜蛋白外還包含其他的膜結(jié)構(gòu)成分，所以將這種膜結(jié)囊泡(圖 1)。Kuehn 等的大量研究發(fā)現(xiàn)，OMVs 生物發(fā)生是一個復(fù)雜各種原因產(chǎn)生了 OMVs，包括包膜應(yīng)激松弛，群體感應(yīng)，防御，長距素反應(yīng)等[60,61]。

布魯氏菌外膜囊泡(OMVs)的制備及免疫原性評價2. 實驗結(jié)果2.1 兩種方法提取的布魯氏菌 043 的 OMVs 形態(tài)比較負染電鏡顯示兩種方法提取的 043 的 OMVs 在形態(tài)方面沒有差異。均為 20～200nm 間的球形囊泡結(jié)構(gòu)，視野下未發(fā)現(xiàn)細菌碎片，證實了 OMVs 的純度較高（1-1）。AB

B 1-1 兩種方法提取的布魯氏菌 043 的外膜囊泡形態(tài)比較SB 液體培養(yǎng)基提取 OMVs；B:方法二 TSA 固體培養(yǎng)基提取 Oigure 1-1 the morphology of OMVs extracted by two methods OMVs extraction by TSB solid medium;B:The second method of Oby TSAliquid media.下對外膜囊泡直徑進行度量，發(fā)現(xiàn)外膜囊泡直徑在 20-16差 30nm），主要集中在 58nm 左右，如圖 1-2。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

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本文編號：2789204