【摘要】：原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范圍內(nèi)惡性腫瘤中發(fā)病率居第五、致死率居第三的惡性疾病。每年全世界約有700,000例新增患者，其中男性發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于女性,且主要集中于東南亞地區(qū)以及非洲撒哈拉沙漠以南區(qū)域，呈現(xiàn)顯著的地域性分布。中國(guó)大陸地區(qū)HCC患者數(shù)量占全世界患者數(shù)量的50%，其中男性發(fā)病率為35.2/100,000，女性發(fā)病率為13.3/100,000。病因?qū)W統(tǒng)計(jì)顯示54%的HCC患者與乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染關(guān)系密切。雖然HBV疫苗的強(qiáng)制接種使目前中國(guó)HBV病毒感染者數(shù)量由9.75%降到7.18%，但由于人口基數(shù)龐大以及已有感染者發(fā)生HCC的滯后效應(yīng)等因素的影響，HBV患者的治療和預(yù)防依然是中國(guó)社會(huì)亟待解決的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題。 HBV基因編碼四種蛋白，包括表面抗原HBsAg、核心區(qū)蛋白（HBeAg和HBcAg）、病毒DNA聚合酶HBp以及HBx。其中HBx是一種多功能的病毒調(diào)節(jié)因子，具有促進(jìn)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞癌的功能。近年來(lái)通過(guò)酵母雙雜交、染色質(zhì)免疫共沉淀、表達(dá)譜芯片分析以及蛋白質(zhì)免疫共沉淀等技術(shù)發(fā)現(xiàn)HBx主要參與調(diào)節(jié)病毒與宿主細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和蛋白質(zhì)降解水平等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，進(jìn)一步證實(shí)了HBx基因功能的復(fù)雜性和多樣性。盡管在HBx基因功能研究中取得較大成績(jī)，但是在研究的策略、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵约澳Ｐ偷募膊顟B(tài)方面存在諸多不足。主要體現(xiàn)為研究策略局限于局部的信號(hào)或代謝通路，缺乏系統(tǒng)性、整體性的分析，或者僅有基因mRNA水平的系統(tǒng)評(píng)價(jià)，缺少蛋白質(zhì)水平的系統(tǒng)分析；實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ投嘁曰颊呓M織樣本或體外培養(yǎng)的細(xì)胞系為主，忽視了細(xì)胞微環(huán)境和遺傳異質(zhì)性等要素對(duì)于HBx致病機(jī)制研究的干擾。此外，HBx引發(fā)的從肝臟炎癥并發(fā)展至癌癥的進(jìn)程中的作用機(jī)制并沒(méi)有得到清晰的闡釋。 本研究旨在利用高覆蓋、高精度的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探索HBx誘發(fā)小鼠肝臟炎癥向癌癥轉(zhuǎn)化的病理生理學(xué)機(jī)制。研究依托HBx轉(zhuǎn)基因致肝癌小鼠模型，選擇分別代表HBx誘發(fā)的肝臟炎癥與癌癥病理狀態(tài)的12個(gè)月（12M）和24個(gè)月（24M）的組織作為實(shí)驗(yàn)材料，以HBx轉(zhuǎn)基因小鼠的同窩正常小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，以避免遺傳背景和外界環(huán)境對(duì)HBx基因功能研究的干擾。選用實(shí)驗(yàn)室制備的重穩(wěn)定性同位素標(biāo)記氨基酸完全標(biāo)記的小鼠作為定量?jī)?nèi)標(biāo)，實(shí)現(xiàn)高精度蛋白質(zhì)組定量。同時(shí)，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，篩選與HBx發(fā)生相互作用的關(guān)鍵分子。以“與HBx相互作用蛋白”為中心點(diǎn)結(jié)合定量蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)，重構(gòu)“HBx-結(jié)合蛋白-信號(hào)效應(yīng)”的HBx網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖。 本研究在國(guó)內(nèi)首次發(fā)展了用于小鼠模型的SILAC整體標(biāo)記方法。利用含有重穩(wěn)定性同位素標(biāo)記賴氨酸（[13C6]-Lysine）的SILAC鼠糧飼養(yǎng)C57BL/6小鼠，實(shí)現(xiàn)代謝過(guò)程中的小鼠蛋白質(zhì)組高標(biāo)記。對(duì)不同器官組織樣品進(jìn)行標(biāo)記效率的LC-MS/MS定量分析，證明F2代小鼠的整體標(biāo)記效率達(dá)到95%以上。其中用于HBx小鼠實(shí)驗(yàn)中的F2代SILAC小鼠肝臟標(biāo)記效率達(dá)到96.34%±0.90%，這為高精度定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究創(chuàng)造了條件。 在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究中，我們共鑒定到162個(gè)與HBx相互作用的蛋白。GO分析顯示這些蛋白質(zhì)涉及細(xì)胞骨架重構(gòu)、線粒體組份、脂代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和RNA可變剪接等諸多過(guò)程。其中47個(gè)已經(jīng)被以前的研究證實(shí)，占鑒定的162個(gè)相互作用蛋白的近30%，顯示了蛋白質(zhì)組學(xué)在研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中的可行性。剩余的115個(gè)蛋白質(zhì)為首次鑒定的和HBx相互作用的蛋白質(zhì)，體現(xiàn)了我們蛋白質(zhì)組檢測(cè)平臺(tái)的靈敏度和高覆蓋蛋白質(zhì)組技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。在這162個(gè)HBx相互作用蛋白中，最大的群體是細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白。共有37個(gè)蛋白質(zhì)屬于這個(gè)類群，包括肌凝蛋白MYL6B、肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白ACTR3B、連環(huán)蛋白β-catenin、驅(qū)動(dòng)蛋白KIF11和KIF5C、血管抑素結(jié)合蛋白AMOT、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白SVIL等。這些蛋白可通過(guò)復(fù)雜的相互作用促進(jìn)細(xì)胞增殖，影響細(xì)胞遷移、管狀結(jié)構(gòu)的形成以及偽足的數(shù)量等，并進(jìn)而影響血管生成。第二大蛋白質(zhì)類群是與線粒體功能活動(dòng)關(guān)系密切的相互作用蛋白，共32個(gè)，包括谷氨酰胺環(huán)化酶γGGCT、脫氧尿苷三磷酸酶DUT、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶APRT、Ca2+的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族分子CAMK2D等。這些蛋白質(zhì)參與核酸和氨基酸代謝、RNA可變剪接等生物學(xué)過(guò)程。特別值得關(guān)注的是HBx不僅可與β脂肪酸氧化進(jìn)程中的脂肪酰輔酶A合成酶ACSF2和脂肪羥酰輔酶A脫氫酶家族成員HADH等2個(gè)限速酶發(fā)生相互作用，而且還與酯酶分子甾醇載體蛋白SCP2、胰腺三酰甘油脂肪酶PNLIP和脂鈣蛋白酶LCN1發(fā)生相互作用，從而干擾肝細(xì)胞脂代謝過(guò)程。這可能是HBV介導(dǎo)肝臟脂肪化和炎癥的主要原因。 在HBx轉(zhuǎn)基因小鼠的蛋白質(zhì)組研究中，我們共鑒定了4744個(gè)蛋白質(zhì)，其中從12MHBx、24M HBx組及其同窩小鼠中分別鑒定了3491、3464和3442、3298（FDR1%）個(gè)蛋白質(zhì)，四組樣品中共同鑒定的蛋白質(zhì)有2504個(gè)（FDR1%）。在定量研究方面，12MHBx和12M WT組定量分析的蛋白質(zhì)有2816個(gè)，定量數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)值整體呈現(xiàn)正態(tài)分布，其SD值為0.20；24M HBx和24M WT組定量分析的蛋白數(shù)目為2731個(gè)，定量數(shù)據(jù)整體分布的SD值為0.42。24M HBx組SD值與12M HBx組SD值相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），表明在HBx介導(dǎo)的從炎癥向癌癥發(fā)生的進(jìn)程中，肝臟組織的異質(zhì)性在逐漸增加。以2.0倍差異作為生物學(xué)差異蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)，我們?cè)?2M HBx組樣品中鑒定了22個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中15個(gè)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，7個(gè)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)；在24M HBx組發(fā)現(xiàn)97個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中72個(gè)上調(diào)，25個(gè)下調(diào)。差異蛋白質(zhì)的GO分析顯示在12M HBx階段肌肉組織發(fā)育等功能顯著異常，這可能與肝臟星狀細(xì)胞活化引發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)纖維化相關(guān)；24M HBx結(jié)果顯示氧化還原、肌肉組織發(fā)育、轉(zhuǎn)錄活性、細(xì)胞骨架組成、糖代謝、脂代謝、小G蛋白信號(hào)途徑等生物學(xué)進(jìn)程顯著富集。尤其是12M和24M HBx介導(dǎo)小鼠肝臟由炎癥向癌癥發(fā)展的過(guò)程中，我們分別鑒定了與CDC42信號(hào)途徑相關(guān)的3個(gè)和15個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，這提示CDC42信號(hào)途徑激活可能是HBx介導(dǎo)肝臟炎癥向癌癥發(fā)展的主要原因。在12M HBx炎癥組織中，雖然沒(méi)有發(fā)現(xiàn)線粒體功能紊亂的線索，但觀察到4個(gè)與脂代謝關(guān)系密切相關(guān)的蛋白如ADFP、DHTKD1、AKR1C18和CES2表達(dá)變化。當(dāng)HBx介導(dǎo)肝臟由炎癥進(jìn)入癌癥階段，18個(gè)線粒體功能相關(guān)蛋白如NDUFA5、LDHD、IVD和DHTKD1等表達(dá)變化顯著。線粒體是細(xì)胞脂肪代謝的主要場(chǎng)所之一，研究結(jié)果暗示脂肪代謝紊亂和線粒體功能失調(diào)可能也是HBx引發(fā)肝臟炎癥進(jìn)展到癌癥的主要原因。 將HBx相互作用蛋白質(zhì)組與定量蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)整合，我們發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)在HBx轉(zhuǎn)染累及的細(xì)胞骨架和線粒體功能方面具有很好的一致性。我們據(jù)此提出“HBx引發(fā)細(xì)胞骨架重塑和線粒體功能失調(diào)擾亂肝細(xì)胞脂代謝過(guò)程，誘發(fā)肝臟由炎癥向癌癥轉(zhuǎn)化”的假設(shè)，并通過(guò)免疫組織化學(xué)和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行了驗(yàn)證，進(jìn)一步說(shuō)明了我們定量蛋白組學(xué)研究結(jié)論的正確性。 在此基礎(chǔ)上，我們從HBx誘發(fā)小鼠肝臟炎癥和癌癥階段呈現(xiàn)相似差異的蛋白質(zhì)中篩選獲得了與細(xì)胞骨架和脂代謝關(guān)系密切的絲切蛋白（Cofilin-1，CFL1）和脂肪分化相關(guān)蛋白（Adipose differentiation-related protein，ADFP）作為肝病發(fā)生和發(fā)展的候選生物標(biāo)志物分子進(jìn)行了深入研究。利用免疫組織化學(xué)分析臨床HBV-HCC和非HBV-HCC肝癌組織樣本中的CFL1和ADFP的表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)CFL1和ADFP在HBV-HCC肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于非HBV-HCC，顯示了CFL1和ADFP具有作為生物標(biāo)志物所必需的保守性和組織特異性。按照肝癌早期預(yù)警與診斷標(biāo)志物應(yīng)具備特異性高、敏感、重現(xiàn)性好和患者依從性優(yōu)等要素，我們又進(jìn)一步分析了HBV、HBV-HCC和HCV等患者的血清樣本中CFL1和ADFP的蛋白質(zhì)豐度，發(fā)現(xiàn)在HBV以及HBV-HCC患者血清中ADFP的豐度顯著升高，而CFL1在血清中未被檢測(cè)到。因此，ADFP可作為HBV誘發(fā)肝細(xì)胞癌早期預(yù)警及診斷的潛在標(biāo)志物。 綜上所述，本研究依托實(shí)驗(yàn)室的高覆蓋和高精度定量蛋白組學(xué)研究技術(shù)平臺(tái)，以HBx轉(zhuǎn)基因鼠為基因功能研究模型和SILAC小鼠作為蛋白組學(xué)定量?jī)?nèi)標(biāo)，深入系統(tǒng)地開(kāi)展了HBx的功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究，揭示了HBx通過(guò)誘發(fā)細(xì)胞骨架重塑和干擾線粒體功能引起肝炎向肝癌發(fā)展的分子機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)大量臨床樣本的研究進(jìn)一步證實(shí)ADFP可能是HBV誘發(fā)的肝細(xì)胞癌的早期預(yù)警及診斷標(biāo)志物，不僅豐富了HBx的生物學(xué)功能及其引發(fā)肝病發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，也為HBV相關(guān)疾病的防診治研究提供了思路和靶標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R735.7;R373.21

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2781189