【摘要】：siRNA是廣泛存在于生物體內(nèi)的非編碼RNA,其介導(dǎo)的RNAi過(guò)程可高效、特異的沉默靶基因,被廣泛應(yīng)用于抗病毒的研究中。已有研究表明,針對(duì)流感病毒M,NP等基因的siRNA能夠通過(guò)抑制基因表達(dá),抑制病毒的增殖。本研究制備了多條針對(duì)PR8病毒抗原基因HA和NA的siRNA,測(cè)定了其對(duì)流感病毒的抑制作用及對(duì)基因組的影響。此外,本研究還嘗試?yán)胹iRNA進(jìn)行流感病毒疫苗株的重配。在第一部分中,設(shè)計(jì)了PR8病毒特異地siRNA。通過(guò)測(cè)序獲得疫苗株P(guān)R8和野毒株H3N2的序列,根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)規(guī)則設(shè)計(jì)了針對(duì)PR8病毒HA、NA基因的特異性siRNA。通過(guò)序列比對(duì)檢測(cè)并排除與H3N2同源的siRNA序列,最終設(shè)計(jì)并合成針對(duì)PR8的HA和NA基因的特異性siRNA序列共12條。其中包括HA和NA特異的長(zhǎng)度為19nt的common siRNA各3條以及長(zhǎng)度為25bp的stealth siRNA各3條。在第二部分中,檢測(cè)了siRNA的抑制效果及特異性。分別在MDCK和MTY6細(xì)胞上優(yōu)化了siRNA抑制實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染試劑、濃度及收毒時(shí)間等條件。根據(jù)優(yōu)化的條件,通過(guò)NA活性、CCID50實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了NA特異的siRNA單條、兩條及三條聯(lián)合使用對(duì)PR8的抑制效果。結(jié)果顯示:NA-105與NA-199聯(lián)合使用的抑制效果最明顯,抑制率為86.07%,且不與H3N2發(fā)生非特異反應(yīng)。通過(guò)NA活性及血凝實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了HA特異的siRNA的抑制效果,顯示:HA-56與HA-802聯(lián)合使用抑制效果明顯,抑制率為57.88%,且不與H3N2發(fā)生非特異反應(yīng)。HA與NA特異的siRNA聯(lián)合使用對(duì)PR8的抑制效率,約為95%,高于上述HA或NA siRNA各自聯(lián)合使用的抑制效果,且對(duì)H3N2無(wú)抑制作用,特異性好。在第三部分中,用HA和NA特異的siRNA進(jìn)行PR8與H3N2病毒的重配。采用三種方式制備病毒混合液:(1)在MTY6細(xì)胞上分別先后感染PR8和H3N2,細(xì)胞病變90%時(shí)收獲病毒混合液;(2)滅活的PR8與未滅活的H3N2共同感染雞胚24h后收獲病毒混合液;(3)滅活的H3N2與未滅活的PR8共同感染雞胚24h后收獲病毒混合液。共同轉(zhuǎn)染NA-105、NA-199和HA-56、HA-802 siRNA抑制病毒混合液中的PR8病毒增殖,通過(guò)噬斑實(shí)驗(yàn)篩選單克隆并用RT-qPCR和RT-PCR對(duì)病毒進(jìn)行鑒定。經(jīng)多輪篩選鑒定并未檢測(cè)到重配株存在,并對(duì)可能的原因進(jìn)行了分析。在MTY6細(xì)胞上用siRNA對(duì)PR8病毒連續(xù)抑制三代后,通過(guò)深度測(cè)序檢測(cè)了siRNA作用下流感病毒基因的突變情況。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)食品藥品檢定研究院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

前 言冒，簡(jiǎn)稱流感，是由流感病毒（influenza virus）引起的急性傳染病圍廣，易引發(fā)局部流行或大流行。據(jù) WHO 報(bào)道，流感每年可引起 ，造成 29 萬(wàn)~65 萬(wàn)例死亡[1]。歷史上四次流感大流行給人類造成了 年的西班牙流感（H1N1），造成全球約 5 億人感染，4000 萬(wàn)~5000今引起的死亡病例相當(dāng)[2, 3]；1957 年的亞洲流感（H2N2）引起了68 年的香港流感（H3N2），造成了全球約 100 萬(wàn)人死亡；1976 年在1N1）造成了約 200 人感染[4, 5]。近幾年流感不斷爆發(fā)，2009 年的0 萬(wàn)人死亡；WHO 統(tǒng)計(jì)截止到 2018 年，高致病性禽流感 H5N1 已造死亡；H7N9 自 2013 年出現(xiàn)以來(lái)，不斷引發(fā)死亡病例，嚴(yán)重危害了社

圖 2 經(jīng)典重配流程圖簡(jiǎn)介small interfering RNA，siRNA）是雙鏈非編碼 RNA 序列，iRNA 介導(dǎo)的基因沉默過(guò)程稱為 RNA 干擾（RNAinterfe線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)，被廣泛應(yīng)用于多種病毒感染的防治中[22]。學(xué)編輯工具，為抗病毒研究開(kāi)啟了新思路。文獻(xiàn)報(bào)道針go1（Argonaute 1）、Ago3（Argonaute 2）、Ago4（ArgoA 鏈。針對(duì)開(kāi)放閱讀框的 siRNA 在 Ago2 蛋白的核酸內(nèi)譯進(jìn)行[23, 24]。毒感病毒增殖的原理是將預(yù)先設(shè)計(jì)的外源性 siRNA 分子轉(zhuǎn)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 蘇藍(lán);張萍;汪楊俊琦;鐘儒剛;;siRNA抑制乙肝病毒的研究進(jìn)展[J];中國(guó)生物工程雜志;2014年09期

2 邵銘;宋紹輝;徐康維;劉書(shū)珍;廖國(guó)陽(yáng);李長(zhǎng)貴;;重配技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)H1N1型流感疫苗病毒株[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2012年04期

3 王利;李康生;;引發(fā)2009年流感暴發(fā)的H1N1新型流感病毒的研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2012年03期

4 方捍華;袁力勇;李長(zhǎng)貴;;大流行流感與甲型H1N1流感[J];中國(guó)藥事;2009年12期

5 李長(zhǎng)貴;;關(guān)于WHO對(duì)大流行流感的危險(xiǎn)性評(píng)估及應(yīng)對(duì)策略綜述[J];中國(guó)藥事;2006年06期

本文編號(hào)：2735875