【摘要】：布魯氏菌病(簡稱布病)是由布魯氏菌引起的一種人獸共患的傳染病,在世界各地都廣泛流行,在發(fā)展中國家尤為嚴(yán)重。目前,控制布魯氏菌病的主要手段是檢出捕殺和免疫動(dòng)物,然而尚無有效的商品化人用疫苗,而動(dòng)物疫苗多為弱毒苗,具有一定的毒性和致病力,難與自然感染區(qū)分開。因此,開發(fā)安全有效的疫苗是控制布病的主要研究內(nèi)容。P39蛋白是羊布魯氏菌免疫保護(hù)候選抗原蛋白,本文以畢赤酵母為宿主表達(dá)P39蛋白,對(duì)其進(jìn)行糖基化修飾,探討其糖基化修飾對(duì)重組蛋白免疫原性的影響,為布魯氏菌新型疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。方法:對(duì)布魯氏菌優(yōu)勢抗原蛋白P39基因進(jìn)行克隆,并構(gòu)建真核表達(dá)載體pPICZαA-P39,電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化GS115感受態(tài)細(xì)胞,Zeocin抗性篩選高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子,優(yōu)化重組蛋白的表達(dá)條件,通過親和層析方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化,分子篩進(jìn)一步純化,BCA法檢測蛋白濃度,液相色譜法檢測其純度,Western blot免疫印跡法對(duì)目的蛋白進(jìn)行鑒定。利用PNGaseF糖苷酶對(duì)重組蛋白進(jìn)行N端糖鏈的釋放,PAS糖原進(jìn)行染色,并利用核磁共振氫譜對(duì)重組蛋白的糖基化修飾進(jìn)行分析,確定其糖基化程度。通過巨噬細(xì)胞對(duì)糖基化蛋白的吞噬作用研究糖基化后的蛋白對(duì)細(xì)胞識(shí)別的影響,通過免疫小鼠實(shí)驗(yàn),檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平、細(xì)胞因子分泌水平、IgG特異性抗體水平等實(shí)驗(yàn)研究其免疫原性的變化。通過Western Blot檢測細(xì)胞表面受體TLR-2、MyD88、TRAF6、TLR-4表達(dá)情況,探討蛋白糖基化修飾對(duì)免疫信號(hào)分子的影響及糖基化影響免疫原性的機(jī)制。結(jié)果:1.對(duì)P39抗原蛋白在畢赤酵母中分泌表達(dá),優(yōu)化發(fā)酵條件發(fā)現(xiàn)在pH 6、甲醇誘導(dǎo)濃度為1%、磷酸鹽濃度為0.02 M的條件下,誘導(dǎo)時(shí)間72h可獲得蛋白5.05g/L。親和層析法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化,高效液相檢測純化后蛋白純度可達(dá)93.77%。Western blot免疫印跡法對(duì)目的蛋白進(jìn)行鑒定,確定其分子量為45 kDa,與P39抗原蛋白相符。2.利用PNGaseF糖苷酶對(duì)重組P39蛋白進(jìn)行水解,結(jié)合核磁共振氫譜結(jié)果表明,畢赤酵母表達(dá)的P39抗原蛋白被糖基化修飾,且糖基化修飾類型為O-糖基化。3.將畢赤酵母表達(dá)的重組蛋白免疫小鼠,MTT法檢測脾淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果發(fā)現(xiàn),重組P39蛋白和原核P39蛋白均可顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖,但重組后的P39蛋白促脾淋巴細(xì)胞增殖的作用明顯高于原核P39蛋白。檢測小鼠血液中特異性IgG抗體變化發(fā)現(xiàn),在免疫小鼠4-6周的時(shí)間內(nèi)均能檢測到較高水平的抗體IgG,真核表達(dá)的P39蛋白IgG抗體表達(dá)水平在5周時(shí)能達(dá)到峰值,且峰值略高于原核P39蛋白。通過檢測細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的分泌水平結(jié)果發(fā)現(xiàn),重組的P39蛋白刺激細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2細(xì)胞因子的水平高于原核蛋白組,說明重組的P39蛋白可能會(huì)更好的激活Th1型細(xì)胞免疫水平。4.巨噬細(xì)胞吞噬熒光標(biāo)記的重組蛋白和原核蛋白,結(jié)果表明巨噬細(xì)胞對(duì)重組P39蛋白的捕獲吞噬作用明顯,且用時(shí)較短,說明重組的P39蛋白更易被巨噬細(xì)胞識(shí)別捕獲。上述結(jié)果說明糖基化修飾后的蛋白其免疫原性明顯高于未修飾蛋白。Western Blot檢測細(xì)胞表面各類受體表達(dá)結(jié)果表明,畢赤酵母重組的P39蛋白與原核表達(dá)的P39蛋白均可引發(fā)細(xì)胞表面受體TLR-2、TRAF6、TLR-4表達(dá),相對(duì)原核P39蛋白,糖基化蛋白可提高TLR-4受體及TRAF6信號(hào)分子的表達(dá),說明糖基化的修飾后的蛋白可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生部分天然免疫,可能是通過TLR-4受體,調(diào)節(jié)TRAF6信號(hào)途徑。結(jié)論:通過對(duì)小鼠免疫原性的初步探索,研究發(fā)現(xiàn)真核P39蛋白和原核P39蛋白都可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng),能分泌大量的IFN-γ細(xì)胞因子,有效促進(jìn)細(xì)胞免疫水平,脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖基化修飾后的P39蛋白能顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖,且糖基化修飾的蛋白免疫后的小鼠抗體水平以及細(xì)胞因子水平均高于原核P39蛋白,糖基化修飾能提高P39蛋白的免疫保護(hù)力,可能是誘導(dǎo)了TLR-4受體信號(hào)途徑,增強(qiáng)天然免疫水平。這為糖修飾P39蛋白作為布魯氏菌疫苗候選抗原奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1.酵母糖基化修飾類型及人源改造類型[52]注：a.釀酒酵母和巴斯德酵母的 N-連接聚糖結(jié)構(gòu)，Man8GlcNAc2 核心結(jié)構(gòu)，進(jìn)入高體后通過分泌途徑產(chǎn)生高甘露糖基化，，通過 α-，β-和磷酸-甘露糖進(jìn)行延伸；b.N-端高糖基化結(jié)構(gòu)改造為唾液酸化雙觸角結(jié)構(gòu)，可用于人類治療糖型；c.釀酒酵母和巴斯德酵發(fā)現(xiàn)的天然 O-端糖基化結(jié)構(gòu)；d.改造后的 O-端聚糖結(jié)構(gòu)為哺乳動(dòng)物糖型的代表結(jié)構(gòu)，別為：O-巖藻糖基化（i）、粘蛋白型（ii）和糖甙類型（iii）糖型。Fig.1 Yeast glycosylation modification type and Human convertion typeNote: (a).N-linked glycan structure for S. cerevisiae and P. pastoris is depicted.This iscomposed of the common Man8GlcNAc2 core structurethat enters the Golgi, and which issubsequently extended with α-, β-, and phospho-mannose as it passes through the secretoryathway to produce a hypermannosylated structure.(b).Through N-linked glycan engineering thypermannosylated structure has been converted to a sialylated bi-antennary structure, which representative of a human glycoform desirable for therapeutic applications.(c). Native O-linkeglycosylation found in both S. cerevisiae and P. pastoris.(d).Through glycan engineering this heen converted into O-linked glycan structures representative of mammalian glycoforms, inclu

果正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測序結(jié)果翻譯后與 GENBANK 中記錄的 P39 基因的氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果完全一致。圖1.1 布魯氏菌基因組中P39基因的PCR電泳結(jié)果M：DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：P39 PCR產(chǎn)物Fig.1.1 The electrophoresis result of PCR product of Brucella genomeM：DL2000 DNA Marker；1：PCR product of P39圖1-2 重組質(zhì)粒pMD19T-P39的雙酶切電泳結(jié)果M：DL5000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：pMD19T-P39 雙酶切產(chǎn)物
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392;S852.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2702191