【摘要】：背景和目的:先天免疫系統(tǒng)被認為是抗病毒感染的第一道防線。病毒感染會激活細胞信號通路,導(dǎo)致細胞因子釋放,如干擾素(IFNs)。IFNs在病毒感染過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。干擾素與細胞表面受體結(jié)合,活化干擾素信號通路,誘導(dǎo)干擾素刺激基因(ISGs)表達。很多ISGs具有抗病毒能力,但它們的抗病毒機制尚有待深入闡明。Viperin又稱cig5或RSAD2,它最初在感染HCMV的原代包皮成纖維細胞中被鑒定。Viperin本底表達水平較低,但多種DNA病毒和RNA病毒能誘導(dǎo)其高表達,誘導(dǎo)表達的Viperin發(fā)揮廣譜抗病毒效應(yīng)。但是,Viperin在柯薩奇病毒3型(CVB3)感染中的作用尚未報道。病毒性心肌炎(VMC)主要由柯薩CVB3導(dǎo)致,CVB3屬于小RNA病毒科腸道病毒屬。病毒性心肌炎是臨床上較為常見的心血管疾病,發(fā)病率逐年升高,尤其是兒童和嬰幼兒。因此,本文主要探討Viperin在CVB3病毒感染過程中的作用及其分子機制。方法:(1)Viperin knockdown(sh Viperin)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,隨后感染CVB3病毒,采用Western Blot方法或?qū)崟r熒光定量PCR方法或倒置熒光顯微鏡研究Viperin對CVB3病毒感染的影響。(2)采用質(zhì)譜方法或免疫共沉淀方法或免疫熒光方法探究Viperin與STAT1相互作用;利用Viperin過表達質(zhì)粒或敲低質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,采用Western Blot方法探究Viperin對STAT1蛋白水平的影響。(3)Mapping:構(gòu)建Viperin與STAT1缺失突變體,利用這些突變體轉(zhuǎn)染細胞,采用免疫共沉淀和Western Blot方法研究Viperin與STAT1的結(jié)合區(qū)域。(4)利用Viperin過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,采用免疫共沉淀和Western Blot方法研究Viperin對STAT1泛素化水平的影響。(5)采用質(zhì)譜方法篩選出與Viperin相互作用的泛素連接酶E3。探究E3連接酶對STAT1蛋白水平和泛素化水平的影響,以及是否依賴于泛素連接酶活性。(6)用CVB3病毒感染細胞,采用免疫共沉淀和Western Blot方法研究CVB3對STAT1蛋白水平和泛素化水平影響,以及Viperin與STAT1蛋白水平的相關(guān)性;結(jié)果:(1)Western Blot方法或?qū)崟r熒光定量PCR方法或倒置熒光顯微鏡結(jié)果顯示:Viperin促進柯薩奇B3病毒(CVB3)感染。(2)采用質(zhì)譜方法篩選出與Viperin相互作用的抗病毒蛋白STAT1。Western Blot結(jié)果顯示:Viperin下調(diào)STAT1蛋白水平,影響了STAT1蛋白的穩(wěn)定性。(3)Mapping結(jié)果顯示:STAT1結(jié)合到Viperin的SAM結(jié)構(gòu)域,并且SAM結(jié)構(gòu)域發(fā)揮降解STAT1功能。Viperin結(jié)合到STAT1的C末端。(4)免疫共沉淀和Western Blot結(jié)果顯示:Viperin泛素化降解STAT1蛋白水平,并且這種降解依賴泛素蛋白酶體系統(tǒng)。(5)采用質(zhì)譜和免疫共沉淀方法篩選出與Viperin相互作用的泛素連接酶UBE4A;實驗結(jié)果顯示:Viperin能夠增加UBE4A與STAT1相互作用,促進UBE4A泛素化降解STAT1蛋白并依賴于泛素連接酶活性。(6)CVB3病毒感染細胞不同時間點,采用q-PCR和Western Blot方法檢測Viperin和STAT1變化。實驗結(jié)果顯示:CVB3誘導(dǎo)Viperin表達增加,并泛素化降解STAT1蛋白水平,Viperin與STAT1的蛋白水平存在一定的負相關(guān)性。結(jié)論:CVB3病毒感染細胞時,誘導(dǎo)Viperin表達增加,Viperin的增加促進了UBE4A與STAT1相互作用,并誘導(dǎo)UBE4A泛素化降解STAT1蛋白,進而負向調(diào)控干擾素信號通路,最終促進CVB3病毒感染。
【圖文】：

圖 1 干擾素信號通路圖(Nature Reviews Immunology, 2008, 8: 559-568.)眾 多 ISGs 中 ， Viperin (virus inhibitory protein, enassociated, interferon-inducible) 因廣譜而顯著的抗病毒功能被rin 是一種高度保守的，含有 361 個氨基酸，，分子量為 42 KDa 的三個不同的結(jié)構(gòu)域組成：一個是 N 端結(jié)構(gòu)域，物種之間存在很性螺旋結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成α螺旋結(jié)構(gòu)，故稱為α Viperin 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及脂滴結(jié)合[17-19]；一個高度保守的中央結(jié)構(gòu)保守的序列 (M1-M4)，其中 M1 含有保守序列 CxxxCxxC，屬于超家族，能夠結(jié)合并催化鐵硫簇，降低 S-腺苷甲硫氨酸向 5’脫為 SAM 結(jié)構(gòu)域[20, 21]；一個 C 末端結(jié)構(gòu)域，它們在物種間表，具有重要的抗病毒功能[22, 23]。Viperin 本底表達水平極低， (I:C)、細菌脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)、雙鏈 DNA 以及多

促進 CVB3 病毒感染的機制研究 結(jié)合，降低 TFP 酶活性，細胞內(nèi) ATP 產(chǎn)生減少，破壞細胞結(jié)構(gòu)，利27]。（2）Viperin 能夠與細胞內(nèi)宿主蛋白發(fā)生相互作用，例如 Viperin 能夠抑制焦磷酸合成酶活性，影響了脂質(zhì)體生產(chǎn)和脂筏結(jié)構(gòu)形成，動性，抑制流感 A 病毒及 HIV-1 病毒出芽及釋放[28-30]；Viperin 與白組裝因子 (CIAO1) 結(jié)合，抑制森林腦炎病毒 (TBEV)[31]。這也在其他宿主蛋白能夠與 Viperin 發(fā)生相互作用，進而影響病毒復(fù)制。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R373

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本文編號：2660590