發(fā)布時間：2020-04-21 02:15

【摘要】：血管系統(tǒng)在維持身體組織的氧和營養(yǎng)供應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。血管生成作為正常生理過程遍布人體各個器官,貫穿胚胎和個體發(fā)育的各個階段,并且與心血管疾病、腫瘤病變、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變、傷口愈合等多種病癥相關(guān)。因此揭示血管新生機制以及血管新生影響因素一直為人們所重視。血管細胞之間以及細胞與環(huán)境之間有復(fù)雜精細的信息聯(lián)系,血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)作為血管中膜的主要成分,可以分泌生長因子激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,通過調(diào)控基因表達使血管發(fā)生增殖、凋亡、遷移、炎性反應(yīng)等多種生物學(xué)效應(yīng)。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類廣泛且多樣地存在于哺乳動物細胞中、具有調(diào)控基因表達作用的內(nèi)源性RNA分子,是近年來的研究熱點之一。然而VSMC是否能夠通過circRNA介導(dǎo)的細胞間通訊影響內(nèi)皮細胞(endothelial cell,EC)生物學(xué)行為還不得而知。本研究擬從circRNA入手,探尋circRNA介導(dǎo)的細胞通訊對血管細胞功能的影響及分子機制。第一部分平滑肌源circ-ZNF609抑制內(nèi)皮VEGFA表達和血管新生目的:本部分研究選擇平滑肌細胞特異性Sirt1-Tg小鼠為研究對象,觀察Sirt1-Tg鼠和野生型(wild typy,WT)小鼠血管新生的差異。篩選、分析兩種小鼠血管組織中差異表達的circRNA,進而在ECs和VSMCs中驗證低氧條件下circRNA的表達變化,同時檢測ECs中VEGFA的表達變化。方法:1.本部分研究選擇平滑肌細胞特異性Sirt1-Tg小鼠為研究對象,將含有或不含血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的基質(zhì)膠植入WT和Sirt1-Tg小鼠皮下,免疫熒光染色觀察Sirt1-Tg和WT小鼠血管新生的差異。2.實時定量PCR篩選、分析兩種小鼠血管組織中差異表達的circRNA,進而在ECs和VSMCs細胞中驗證低氧和SIRT1對circRNA的表達影響。同時western blot檢測ECs中VEGFA的表達水平變化。結(jié)果:1.Sirt1-Tg小鼠血管新生能力減弱。2.提取Sirt1-Tg和WT小鼠血管平滑肌細胞總RNA,篩選差異表達的circRNA,發(fā)現(xiàn)circ-ZNF609在VSMCs和ECs中表達量豐富,并且低氧誘導(dǎo)Sirt1-Tg血管平滑肌細胞circ-ZNF609表達并可進入ECs。3.VSMC源circ-ZNF609抑制內(nèi)皮細胞VEGFA表達。第二部分circ-ZNF609抑制內(nèi)皮HIF1α核轉(zhuǎn)位和VEGFA的轉(zhuǎn)錄激活目的:基于第一部分的發(fā)現(xiàn)和前人研究報道,本部分以circ-ZNF609和HIF1α為研究對象,試圖從circ-ZNF609與HIF1α的關(guān)系入手,尋找circ-ZNF609在血管新生中對VEGFA的具體調(diào)控機制。方法:1.敲低和過表達circ-ZNF609后利用Western blot和免疫熒光技術(shù)檢測HIF1α表達水平和核轉(zhuǎn)位的變化。2.利用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation assay,RIP)、RNA pull-down和熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization,FISH)研究RNA-蛋白質(zhì)互作;用染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,CHIP)確認(rèn)circ-ZNF609對VEGFA轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。結(jié)果:1.在EC中敲低circ-ZNF609后,HIF1α由胞漿進入細胞核增多,HIF1α胞漿/胞核轉(zhuǎn)位增強;相反過表達circ-ZNF609抑制HIF1α核轉(zhuǎn)位。2.RIP、RNA pull-down和FISH結(jié)果均顯示,circ-ZNF609和HIF1α二者相互作用、在胞漿共定位。3.過表達circ-ZNF609后,轉(zhuǎn)錄因子HIF1α在VEGFA基因啟動子區(qū)的富集顯著減弱。第三部分結(jié)直腸癌細胞circ-ZNF609的表達特征及其對血管平滑肌細胞行為的影響目的:結(jié)直腸癌是常見且嚴(yán)重危害健康的消化道腫瘤之一,腫瘤的發(fā)生發(fā)展離不開腫瘤血管的生成。本部分試圖觀察血管發(fā)生過程中腫瘤細胞對VSMCs行為學(xué)特性的影響,并驗證circ-ZNF609是否參與上述調(diào)控過程。方法:1.通過熒光實時定量PCR檢測circ-ZNF609在結(jié)直腸癌細胞和培養(yǎng)基中的表達變化。2.用MTT、細胞計數(shù)和western blot驗證腫瘤條件培養(yǎng)基(tumor conditioned medium,TCM)對VSMC增殖的影響。3.利用Annexin V-FITC/PI、TUNEL和JC-1法檢測TCM對平滑肌細胞凋亡的影響。4.免疫組織化學(xué)染色驗證結(jié)直腸癌組織微血管和平滑肌變化,熒光實時定量PCR驗證circ-ZNF609在結(jié)直腸癌組織中的表達變化。結(jié)果:1.結(jié)直腸癌細胞和培養(yǎng)基中circ-ZNF609表達水平均較正常腸上皮細胞中下降。2.TCM抑制VSMCs增殖,但并未影響VSMC中PCNA的表達。3.TCM通過誘導(dǎo)VSMCs中Caspase-3活化,Bax/Bcl-2比值增加誘導(dǎo)VSMCs凋亡。4.結(jié)直腸癌組織中MVD增加,血管壁VSMC表達減少,同時伴有circ-ZNF609表達下降。結(jié)論:1.低氧可誘導(dǎo)Sirt1-Tg-VSMC表達和分泌circ-ZNF609。2.平滑肌源circ-ZNF609可介導(dǎo)平滑肌-內(nèi)皮細胞通訊,抑制內(nèi)皮VEGFA表達和血管新生。3.circ-ZNF609與HIF1α相互作用,抑制HIF1α漿/核轉(zhuǎn)位,降低VEGFA轉(zhuǎn)錄活性。4.結(jié)直腸癌細胞circ-ZNF609表達分泌減少,其條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)VSMCs凋亡。
【圖文】：

圖 1-1 Sirt1-Tg 小鼠血管新生能力減弱Fig.1-1 The over-expression of SIRT1 impairs angiogenesis in Sirt1-Tg A. Representative image and quantification of CD31-positive vessecryopreserved, sectioned, and immunofluorescently stained Matrigel pfrom WT mice and Sirt1-Tg mice (n=5 mice per group; Scale bar 100μAll data are expressed as mean ±SEM, **P<0.01.

27圖 1-3 VSMC 源 circ-ZNF609 抑制內(nèi)皮細胞 VEGFA 表達Fig.1-3 VSMC-derived circ-ZNF609 inhibits endothelial cell VEGFAexpressionA. Quantitative PCR and Western blot analysis of VEGFA expression inprimary cultured ECs which were exposed to 21% or 1% O2 for 24 hours.Data are presented as the mean ± SEM, *P<0.05.B. Quantitative PCR and Western blot analysis of VEGFA expression inprimary cultured ECs which were incubated with VSMC media. Data are
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R346

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本文編號：2635237