【摘要】：皮膚創(chuàng)傷愈合是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程,它啟動一系列復(fù)雜的生物學(xué)事件,包括炎癥、組織新生及組織重構(gòu)[1]。雖然許多研究采用不同的方法治療皮膚創(chuàng)傷修復(fù),但愈合質(zhì)量低、附屬器官不可再生等依然是皮膚創(chuàng)傷愈合過程中的關(guān)鍵問題。目前,皮膚移植是修復(fù)大面積皮膚損傷的最有效方法。其中,應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone mesenchymal stem cells, BMSCs)治療重癥皮膚創(chuàng)傷展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。已有研究結(jié)果證實BMSCs在促進創(chuàng)面愈合方面起到積極的作用。Badiavas將骨髓間充質(zhì)干細胞移植到深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面,發(fā)現(xiàn)其明顯促進創(chuàng)面的愈合[2]。付小兵等將BMSCs移植至豬深度燒傷創(chuàng)面,發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面愈合速度明顯加快,表皮增厚,真皮神經(jīng)纖維增多,大大改善了創(chuàng)面愈合質(zhì)量[3]。文獻報道BMSCs還參與表皮、汗腺及創(chuàng)面血管的重建[4]。這些研究結(jié)果表明BMSCs是非常好的皮膚組織工程種子細胞。 創(chuàng)傷愈合的各個階段都有生長因子的參與和調(diào)控,生長因子對治療慢性難愈合皮膚創(chuàng)口和大面積燒傷創(chuàng)面有著廣闊的應(yīng)用前景[5]�；罨�(Activin)是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor β, TGF β)超家族成員,成熟組織內(nèi),Activin信號可調(diào)節(jié)傷口愈合和表皮再上皮化,在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中具有重要的作用[6]。而且Activin和其拮抗劑卵泡抑素(Follistatin)共同調(diào)節(jié)毛囊的發(fā)育和周期循環(huán)[7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Activin B在In vitro水平上通過JNK/MAPK信號通路促進角朊細胞的遷移,從而加速創(chuàng)傷修復(fù)過程[8,9，10]；近期研究顯示：在In vivo水平上,Actvin B通過RhoA-JNK-cJun信號通路調(diào)節(jié)傷口愈合,并且在毛囊的再生和毛囊細胞的增殖方面起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[11]。 干細胞從定居的部位進入到相應(yīng)的組織器官內(nèi)才能實現(xiàn)該部位的再生和修復(fù),而細胞遷移的過程是受趨化因子、趨化因子受體系統(tǒng)所調(diào)控的[12,13]。在創(chuàng)傷愈合的過程中,Activin/TGF-β是趨化因子之一,可以通過不同的方式作用于炎癥及修復(fù)細胞,調(diào)節(jié)細胞的趨化性遷移、增殖分化和細胞外基質(zhì)合成與分泌[14]。研究發(fā)現(xiàn)BMSCs表面高度表達Activin受體,而且Activin/TGF-β通路下游信號分子Smad3的缺失導(dǎo)致BMSCs遷移能力降低[15.16,17],提示Activin/TGF-β信號可能在調(diào)控BMSCs的生物學(xué)功能上發(fā)揮重要作用。因此鑒于BMSCs能加速創(chuàng)傷愈合并促進皮膚血管及汗腺等組織的再生,而Activin B能促進BMSCs的遷移,我們假設(shè)Activin B可能改善了BMSCs介導(dǎo)的創(chuàng)傷修復(fù),為了驗證假設(shè)我們提出將Activin B和BMSCs聯(lián)合起來,觀察其治療創(chuàng)傷愈合的作用,并在細胞水平上探索其可能的信號機制。本研究為臨床治療創(chuàng)傷修復(fù)提供了新的理論及實驗依據(jù)。 (一)目的 探討Activin B聯(lián)合BMSCs對治療大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的影響。 (二)方法 24只健康成年SPF級SD大鼠隨機分為四個組：PBS對照組,BMSCs組,Activin B組和Activin B聯(lián)合BMSCs組。10%水合氯醛(0.003ml/g)腹腔注射麻醉,SD大鼠背部兩側(cè)剪毛后用蜂蜜脫毛凍蠟脫毛,制作面積為1cm2正方形切口,深達皮下。術(shù)后動物自由進食、水。術(shù)后每天用細Mark筆將各組未愈合創(chuàng)面面積描記在透明薄膜上,利用數(shù)碼相機在相同的條件下對描記下的圖像拍照,IPP圖像分析系統(tǒng)計算未愈合創(chuàng)面面積,計算創(chuàng)面愈合率,愈合率=(原始創(chuàng)面面積—未愈合的創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。術(shù)后3d、7d、14d、21d取傷口周圍0.5cm皮膚,PBS沖洗,4%多聚甲醛固定,PBS沖洗,乙醇逐級脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。切片(5μm),二甲苯脫蠟,乙醇逐級復(fù)水,常規(guī)的蘇木精伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色。 (三)結(jié)果 與Activin B、BMSCs組及PBS組相比,ActivinB聯(lián)合BMSCs組可以顯著促進SD大鼠皮膚創(chuàng)面愈合,移植后第7d、14d,Activin B聯(lián)合BMSCs組創(chuàng)面愈合率顯著高于Activin B、BMSCs組及PBS組。移植后第12d,Activin B聯(lián)合BMSCs處理組的12個創(chuàng)口(n=6)已完全閉合,而Activin B、BMSCs組及PBS組傷口尚未完全閉合。Activin B組和BMSCs組于移植后14d創(chuàng)面完全愈合,而PBS組創(chuàng)面完全閉合發(fā)生于第16d。第14d HE結(jié)果顯示Activin B、BMSCs組及Activin B聯(lián)合BMSCs處理組已經(jīng)完成再上皮化,而且與PBS組和BMSCs組相比,Activin B組和Activin B聯(lián)合BMSCs可以促進皮膚毛囊的再生,提示Activin B聯(lián)合BMSCs不但可以促進急性創(chuàng)傷的愈合還可以促進傷口部位毛囊的再生。(四)結(jié)論 以上研究結(jié)果提示Activin B聯(lián)合BMSCs能夠促進大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合。 (一)目的 在細胞(In vitro)水平及載體(In vivo)水平上探討Activin B通過何種途徑誘導(dǎo)BMSCs從而促進創(chuàng)傷愈合。 (二)方法 在細胞(In vitro)水平上利用免疫組化觀察K15,K19的表達；利用細胞劃痕實驗、細胞趨化實驗、細胞的Actin結(jié)構(gòu)觀察實驗記錄細胞遷移情況；在載體(In vivo)水平上利用Brdu標(biāo)記觀察創(chuàng)傷愈合過程中細胞增殖的變化。 (三)結(jié)果 1.K15,K19的表達：24孔板中放入coverglass,第4代BMSCs接種其中,每孔細胞含量約1×104個,分別用含5%胎牛血清的DMEM(PBS組)和5%胎牛血清+10ng/mlActivin B的DMEM (Activin B組)培養(yǎng)。從培養(yǎng)第一天起開始直到第21d,隔天一次,取出coverglass,進行細胞免疫化學(xué)檢測。結(jié)果顯示：PBS組和Activin B組相比,K15,K19的表達均未見顯著性差異。 2. Brdu標(biāo)記增殖細胞：進一步利用Brdu檢測傷口周圍組織細胞增殖發(fā)現(xiàn)：創(chuàng)傷后第7dBMSCs組、Activin B組與Activin B聯(lián)合BMSCs組表皮基底層部位Brdu陽性細胞數(shù)增加與PBS組相比無顯著差異。創(chuàng)傷后第14dBMSCs組、Activin B組和Activin B聯(lián)合BMSCs組表皮基底層部位Brdu陽性細胞數(shù)增加分別與PBS組相比有顯著差異,而BMSCs組、Activin B組和Activin B聯(lián)合BMSCs組表皮基底層Brdu陽性細胞數(shù)增加兩兩相比均無顯著差異。據(jù)此進一步認為Activin B并非通過調(diào)節(jié)BMSCs的增殖,從而促進皮膚創(chuàng)傷愈合。 3.細胞遷移實驗結(jié)果顯示：Activin B作用30min后,肌動蛋白纖維主要分布于細胞膜附近,2h時,肌動蛋白單體重組生成大量的肌動蛋白纖維鋪滿整個細胞并持續(xù)至4h,6h后大量肌動蛋白纖維解聚僅部分存在細胞膜附近,而PBS組細胞肌動蛋白纖維數(shù)量和分布沒有變化,因此認為Activin B調(diào)節(jié)BMSCs肌動蛋白單體的聚合。細胞肌動蛋白的聚合在細胞遷移過程中起到關(guān)鍵作用,那么Activin B是否調(diào)節(jié)BMSCs的遷移呢?進一步用細胞劃痕實驗證明,劃痕后72h,與PBS組相比,Activin B組細胞已經(jīng)遷移至傷口,提示Activin B促進BMSCs向傷口部位遷移。繼而利用Transwell進行細胞趨化遷移實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與PBS組相比,Activin B組遷移至下室膜上細胞數(shù)明顯高于PBS組,表明ActivinB誘導(dǎo)趨化BMSCs的遷移。上述結(jié)果提示Activin B通過調(diào)節(jié)肌動蛋白重組誘導(dǎo)BMSCs的趨化遷移促進傷口愈合。 (四)結(jié)論 Activin B主要通過誘導(dǎo)BMSCs的遷移,從而起到促進皮膚創(chuàng)傷愈合。 (一)目的 在細胞(In vitro)水平上探討Activin B誘導(dǎo)BMSCs遷移的相關(guān)信號傳導(dǎo)通路。 (二)方法 第四代BMSCs分別經(jīng)JNK特異性抑制劑SP600125(5μmol)、p38特異性抑制劑SB202190(5pμmol)、ERK特異性抑制劑SL327(5μmol)處理細胞30min后,利用Phallotoxins染色觀察Activin B誘導(dǎo)的BMSCs骨架蛋白的變化及劃痕后細胞遷移情況。應(yīng)用Western Blotting檢測Activin B誘導(dǎo)的BMSCs p-JNK, p-ERK和p-p38的表達。 (三)結(jié)果 1. Phallotoxins染色：Activin B作用2h時,JNK特異性抑制劑SP600125和ERK特異性抑制劑SL327顯著地抑制由Activin B誘導(dǎo)的肌動蛋白絲重組,而p38特異性抑制劑SB202190處理細胞,Activin B刺激2h后大量的肌動蛋白重組聚合并分布整個細胞。 2.細胞劃痕實驗結(jié)果：BMSCs經(jīng)特異性JNK抑制劑SP600125及特異性ERK抑制劑SL327處理后發(fā)現(xiàn)：Activin B誘導(dǎo)的BMSCs遷移作用受到抑制,細胞劃痕后72h,僅經(jīng)過特異性p38抑制劑SB202190處理后的BMSCs創(chuàng)面有大量的遷移細胞,而PBS組,SP600125+Activin B組和SL327+Activin B組創(chuàng)面僅有較少的遷移細胞。 3. Western Blotting結(jié)果：Activin B作用于BMSCs后10min JNK和ERK迅速磷酸化至30min達到最高水平,2h時p-JNK恢復(fù)至基礎(chǔ)水平,而2h時p-ERK磷酸化水平稍下降,但是p38磷酸化處于基礎(chǔ)水平。 (四)結(jié)論 上述結(jié)果顯示Activin B通過MAPK家族的JNK和ERK信號通路介導(dǎo)BMSCs肌動蛋白重組聚合和遷移。 (一)目的 探討骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合生長因子對治療皮膚創(chuàng)傷最為有效的移植途徑。 (二)方法 將18只大鼠隨機分為表皮移植組、尾靜脈移植組和實驗對照組。大鼠均建立全層皮膚缺損模型,手術(shù)后連續(xù)三天,用含有活化素(Activin B)(lOng/ml)的PBS重懸,繼而用綠色熒光染料CFSE標(biāo)記BMSC混懸液0.4mL,按照細胞數(shù)為1×106BMSC/天,分別通過表皮和尾靜脈移植到全層皮膚缺損模型的大鼠中,對照組移植同等劑量的生理鹽水。移植后3d、7d利用活體成像儀觀察不同途徑的移植情況,追蹤觀察到14d直到全皮愈合；用冰凍切片觀察各組創(chuàng)面及不同臟器CFSE標(biāo)記BMSCs移植的情況；并于3d、7d、14d記錄大鼠皮膚創(chuàng)面面積、創(chuàng)面愈合率,不同時間點取組織標(biāo)本制作石蠟切片,常規(guī)HE染色觀察。 (三)結(jié)果 1.活體成像儀3d、7d觀察實驗組大鼠皮膚創(chuàng)面均有熒光顯示,而對照組創(chuàng)面處無熒光顯示。冰凍切片結(jié)果顯示CFSE標(biāo)記的BMSCs,創(chuàng)傷后第3dActivinB聯(lián)合BMSCs表皮移植組已移植入創(chuàng)面處,Activin B聯(lián)合BMSCs尾靜脈移植組可以觀察到向傷口遷移的趨勢。創(chuàng)傷后第7dActivin B聯(lián)合BMSCs表皮移植組傷口部位移植的BMSCs遷移至傷口邊緣參與創(chuàng)傷的愈合,Activin B聯(lián)合BMSCs尾靜脈移植組在創(chuàng)傷邊緣再上皮化部位也可見綠色熒光,對照組無。臟器冰凍切片結(jié)果顯示：Activin B聯(lián)合BMSCs表皮移植組和Activin B聯(lián)合BMSCs尾靜脈移植組肺臟綠色熒光表達最強,腎臟也見少量綠色熒光表達而心臟、肝臟未見綠色熒光,PBS組均未見綠色熒光。 2.術(shù)后第7d、14dBMSCs移植組創(chuàng)面愈合率均高于對照組(P0.05),而表皮移植組與尾靜脈移植組相比無統(tǒng)計學(xué)意義。第14d HE結(jié)果顯示ActivinB聯(lián)合BMSCs表皮注射組及Activin B聯(lián)合BMSCs尾靜脈注射組均已經(jīng)完成再上皮化,而且與PBS組相比,Activin B聯(lián)合BMSCs表皮注射組及Activin B聯(lián)合BMSCs尾靜脈注射組可以促進皮膚毛囊的再生。 (四)結(jié)論 Activin B聯(lián)合BMSCs經(jīng)局部移植和尾靜脈移植均可以遷移至皮膚創(chuàng)傷部位并參與皮膚創(chuàng)傷的修復(fù),相對于尾靜脈移植,局部移植在創(chuàng)傷修復(fù)中更簡便易行。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻】

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本文編號：2586887