【摘要】：第一部分骨髓源性間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和分化 目的：探討小鼠骨髓源性間充干細胞(mesenchymal stem cells MSCs)體外培養(yǎng)、鑒定、分化的方法,研究間充質(zhì)干細胞在體外環(huán)境下向內(nèi)皮細胞分化的效率和功能變化。 方法：分離小鼠股骨、脛骨,肝素抗凝,沖出骨髓,以Percoll密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法聯(lián)合分離、培養(yǎng)、純化骨髓間充質(zhì)干細胞。我們通過MTT法制備骨髓干細胞體外生長曲線。以CD29、CD90、CD105、CD34、CD45單克隆抗體通過流式細胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細胞表面標志。通過以地塞米松、胰島素等誘導P3代MSC向脂肪細胞分化,誘導后,以油紅染色鑒定分化的脂肪細胞。以VEGF誘導MSC向內(nèi)皮細胞分化,以CD34、KDR等內(nèi)皮細胞表面標志鑒定誘導后的內(nèi)皮細胞。 結果：(1)密度梯度離心結合貼壁培養(yǎng)法分離細胞,細胞接種12h后,可見有圓形或橢圓形細胞貼壁,72h后出現(xiàn)散在的紡錘狀貼壁細胞,細胞培養(yǎng)1O天后,出現(xiàn)致密的貼壁細胞層,此時細胞的兩極開始有規(guī)律地排列成束狀。(2)CD29、CD90、CD105流式檢測MSC表面標志,陽性率均在90%以上。CD34、CD45則都低于8%。(3)骨髓干細胞P3向脂肪細胞誘導后,加入油紅O染液顯示細胞內(nèi)有橙紅色脂肪滴呈現(xiàn)。(4)骨髓干細胞經(jīng)血管內(nèi)皮因子誘導誘導一周時,有散在的鵝卵石樣細胞出現(xiàn)。誘導兩周后,形成致密的貼壁細胞層,大部分細胞呈圓形或卵形形,細胞呈“鋪路石”樣排列。CD34、KDR陽性率分別為89.24±6.37%,85.19±4.52%。FITC-UEA-1, DiI-acLDL雙染誘導后內(nèi)皮細胞陽性率為89.83±4.49%。同時,誘導后的內(nèi)皮細胞在體外保持良好的成管能力。 結論：密度梯度離心法結合貼壁培養(yǎng)法可以在體外分離、培養(yǎng)出高純度骨髓間充質(zhì)干細胞。骨髓間充質(zhì)干細胞在體外經(jīng)過傳代培養(yǎng)后,依舊具有多向分化潛能。 目的：以己內(nèi)酯和碳酸亞乙酯為原料合成可降解高分子聚合物聚己內(nèi)酯-碳酸亞乙酯Poly(EC-CL),通過靜電紡技術制備納米Poly (EC-CL)電紡膜。 方法：以甲苯為溶劑,通過稀土配合物Nd(DBMP)3催化碳酸亞乙酯和CL開環(huán)共聚合。NMR檢測聚合物化學結構,FTIR傅里葉全反射紅外光譜分析聚合物中特征集團的變化。以六氟異丙醇為溶劑,EC/CL共聚物比例為1：9,1：6,1：4的Poly(EC-CL)共聚物為原料,分別制備不同濃度的電紡膜,通過掃描電鏡(SEM)觀察紡絲膜的纖維形貌。力學性能測試檢測各組電紡膜的拉伸強度、楊氏模量和斷裂伸長率。 結果：從共聚物Poly (EC-CL)紅外圖譜證實聚合物為酯類聚合物,通過核磁共振圖譜沒有發(fā)生EC單體的均聚合和脫C02副反應發(fā)生,所得共聚物為無規(guī)共聚物。在poly (EC-CL)濃度為5%時,當EC/CL從1：9上升到1：4時,纖維直徑從212±52nm上升到522±68nm,poly(EC-CL)濃度為10%時,當EC/CL從1：9上升到1：4時,纖維直徑從535±79nm上升到956±142nm,poly (EC-CL)濃度為15%時,EC/CL為1：9時,電紡膜纖維直徑為867±93nm,而EC/CL濃度為1：6和1：4時,不能形成有效電紡紡絲。力學性能測試發(fā)現(xiàn)隨著EC含量的增高,聚合物拉伸強度、屈服強度和楊氏模量逐漸下降,而斷裂伸長率隨EC含量增高而增大。 結論：Poly (EC-CL)的濃度影響電紡纖維膜的形態(tài),Poly (EC-CL)是一種力學性能可調(diào)控的新型可降解高分子材料。 目的：以合成高分子材料Poly(EC-CL)和血管內(nèi)皮生長因子VEGF為原料,利用靜電紡絲技術構建具有良好細胞相容性和機械性能的納米支架。 方法：將VEGF與Poly (EC-CL)混合,配置成質(zhì)量比為Ong/g、10ng/g、100ng/g、1ug/g的溶液,電壓15kV,流速2m1/h電紡納米纖維支架。掃描電鏡檢測電紡膜納米形態(tài),細胞增殖試驗、Live/Dead細胞試劑盒檢測試驗、細胞黏附試驗、LDH釋放試驗、間接接觸溶血試驗、皮下植入試驗檢測電紡膜細胞相容性和血液相容性。Poly (EC-CL)電紡膜誘導分化MSCs試驗檢測電紡膜內(nèi)VEGF體外分化MSC的能力。 結果：混合VEGF的poly (EC-CL)與純poly (EC-CL)聚合物膜片相比,纖維形態(tài)沒有分別,納米纖維直徑在440±55nm,我們增加VEGF含量,纖維直徑?jīng)]有明顯變化(p0.05)。細胞增殖試驗、Live/Dead細胞試劑盒檢測試驗、細胞黏附試驗證實Poly(EC-CL)/VEGF電紡膜具有良好的細胞性容性,VEGF/poly (EC-CD (100ng/g;1μg/g)組上細胞明顯高于poly (EC-CL)和VEGF/poly (EC-CL)(10ng/g)(P0.05)。間接接觸溶血試驗各組溶血率均6%,皮下植入試驗膜片四周炎癥反應輕微。當VEGF含量100ng/g時,可以有效誘導MSC向內(nèi)皮細胞分化。 結論：Poly (EC-CL)/VEGF共聚物具有良好的細胞相容性、組織相容性和血液相容性,能夠作為生物醫(yī)用植入材料。當VEGF含量100ng/g時,可以有效誘導MSC向內(nèi)皮細胞分化。 目的：完成仿生肝臟三維空間血管網(wǎng)絡的構建,明確這一組織工程實質(zhì)臟器三維血管網(wǎng)絡構建新方法的可行性。 方法：利用64排CT采集正常人肝臟血管并轉換成4cm×4cm血管斷層平面坐標圖,根據(jù)血管不同斷面平面坐標圖進行激光打孔處理。SEM檢測打孔后,膜片變化。將打孔后的各膜片按次序通過基質(zhì)膠粘貼在一起。以GFP-腺病毒標記骨髓干細胞誘導的內(nèi)皮細胞,將標記的內(nèi)皮細胞灌注于仿生血管網(wǎng)絡中。放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),在培養(yǎng)的第3周檢測血管形成狀況。 結果：激光打孔后,掃描電鏡觀察孔徑邊緣,孔徑邊緣光滑平整。經(jīng)3周后免疫熒光檢測,可見管壁形成內(nèi)皮細胞層。 結論：本研究針對組織工程臟器血管網(wǎng)絡的構建,將為今后組織工程臟器構建奠定研究基礎,有助于推動代謝功能性組織工程臟器的研究進展。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：2584693