【摘要】：程序化細(xì)胞死亡因子5(programmed cell death5，PDCD5)是北京大學(xué)人類疾病基因研究中心從白血病細(xì)胞株TF-1細(xì)胞中克隆得到的一個基因。該基因種屬之間進(jìn)化高度保守，在50多種組織中都有表達(dá)，其表達(dá)在腫瘤組織中下調(diào)，免疫缺陷病上調(diào)，和疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相連。因此，PDCD5蛋白的定量檢測方法的建立和研究，對PDCD5蛋白的研究和疾病的臨床診斷等方面具有重要的現(xiàn)實意義。 本研究采用基因工程重組PDCD5蛋白作為免疫原，免疫6～8周BALB/C小鼠，通過細(xì)胞融合、有限稀釋法篩選獲得3株能夠穩(wěn)定分泌抗PDCD5蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為PDCD5-A2、PDCD5-D1、PDCD5-H3，制備腹水并純化。經(jīng)鑒定，此三株單克隆抗體的免疫球蛋白均為IgG1,效價達(dá)到105以上，具有良好的特異性。用重組PDCD5蛋白免疫新西蘭大白兔，制備兔抗PDCD5白蛋多克隆抗體，經(jīng)瓊脂擴(kuò)散實驗檢測效價達(dá)到1：32。將制備的多克隆抗體經(jīng)硫酸銨初步純化后再經(jīng)層析法對其進(jìn)一步純化，經(jīng)鑒定獲得純度較高的抗體。然后采用高碘酸鈉法對單抗和多抗分別進(jìn)行辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記，經(jīng)雙擴(kuò)散檢測標(biāo)記后的抗體和酶均有活性。 用純化多克隆抗體作為包被抗體，標(biāo)記的單克隆抗體做為酶標(biāo)抗體，具有活性。初步建立檢測PDCD5蛋白的定量雙抗體夾心ELISA檢測方法，該檢測方法對高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、脂聯(lián)素、甲胎蛋白、血紅蛋白等無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。用本實驗建立的ELISA檢測方法檢測正常人血清55份、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)標(biāo)本21份和各種癌癥標(biāo)本81份，統(tǒng)計學(xué)處理用t檢驗，結(jié)果顯示癌癥樣本血清中PDCD5水平（17.52±4.32ng/ml）顯著低于正常人血清（20.43±5.32ng/ml）（P0.05）；而乳腺癌（17.24±4.30ng/ml）、骨髓瘤（18.04±2.11ng/ml）、食管癌（17.54±1.27ng/ml）和肺癌（18.13±4.26ng/ml）各種癌癥患者血清中PDCD5蛋白含量無顯著性差異（P0.05）；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎樣本血清中PDCD5含量（35.94±17.12ng/ml）顯著高于正常人血清（P0.01）具有統(tǒng)計學(xué)意義。 本研究以重組蛋白免疫BALB/C鼠和新西蘭大白兔制備單克隆抗體和多克隆抗體，初步建立了PDCD5蛋白的定量雙抗體夾心ELISA檢測方法，，并利用本方法探討血清PDCD5含量變化與疾病的相關(guān)性，為疾病的輔助診斷提供一種新的方法。
【圖文】：

圖1 PDCD5的基因及cDNA結(jié)構(gòu)利用FIRSTEF軟件，根據(jù)contig NT_011109.15將PDCD5及其上游的1200bp進(jìn)行啟動子預(yù)測，未發(fā)現(xiàn)典型啟動子區(qū)域。但是CpG島分析提示，PDCD5上游序列富含G/C，并具有典型的CpG島，可能具有啟動子活性。Xu等通過熒光素報告酶系統(tǒng)的研究，證明PDCD5上游序列具有極強的啟動子活性[11]。1.1.2 PDCD5蛋白的分子特性人PDCD5 蛋白全長含125 個氨基酸，分子量為14285 道爾頓，等電點5.78。氨基酸序列中無半胱氨酸和色氨酸，提示其不含有二硫鍵。PDCD5也無明顯的疏水區(qū)、跨膜區(qū)和信號肽，表明其不是分泌蛋白或膜蛋白。表達(dá)譜分析證明人PDCD5表達(dá)較廣，胚胎組織表達(dá)量低于成年組織，腫瘤細(xì)胞表達(dá)量低于正常組織。細(xì)胞中PDCD5以中或低水平定位在胞質(zhì)和胞核。用NMR方法對PDCD5蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示PDCD5蛋白分子包含6個α螺旋。其中Lys33-Thr103區(qū)域折疊為球蛋白，包含4個α螺旋，螺旋之間

4、5、6：硫酸銨沉淀純化后 PDCD5-A2、PDCD5-H3、PDCD5-H3；7、8、9：腹水（稀釋四倍后）PDCD5-A2、PDCD5-H3、PDCD5-H3圖.3-1 單克隆抗體純度結(jié)果由上圖可知通過兩步純化后電泳圖幾乎無雜帶，抗體純度可達(dá) 96%。根據(jù)濃度計算公式：蛋白濃度（mg/mL）=OD280nm×1.45- OD260nm×0.74 ，測得三株單抗的濃度分別為 0.964 mg/mL（PDCD5-A7）、0.781 mg/mL（PDCD5-D1）、1.2 mg/mL（PDCD5-H3）。3.9 兔血清效價檢測第三次免疫后，從新西蘭大白兔耳靜脈取血，離心取上清，采用雙向瓊脂擴(kuò)散實驗檢測效價結(jié)果如圖。
【學(xué)位授予單位】：河南工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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