【摘要】：研究背景 肺炎嗜衣原體（Chlamydophila pneumoniae, Cpn）是一類重要的呼吸道病原體，造成全球約10%的社區(qū)獲得性肺炎及5%支氣管炎和竇炎病例的發(fā)生，還與冠心病、動脈粥樣硬化、哮喘、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等多種慢性疾病相關(guān)。許多國家的人群Cpn感染率占全國人口的50%~70%，但人群感染該菌后多表現(xiàn)為持續(xù)的“隱蔽性”，患者病情易被忽視而導(dǎo)致Cpn感染反復(fù)遷延，造成機體不可逆的病理改變甚至嚴重并發(fā)癥。研究Cpn的致病因素，闡明毒力相關(guān)蛋白的致病作用及機制對預(yù)防Cpn感染，控制其傳播具有重要意義。 Cpn感染引起的炎癥反應(yīng)是多種疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。其中，Cpn熱休克蛋白（Heat Shock Proteins, HSPs）在病原體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中可能發(fā)揮重要作用。為研究CHSPs在Cpn誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的功能及其相關(guān)受體及信號通路，進一步說明CHSPs在炎癥/免疫病理損傷中的作用及其可能的致病機制，擬運用細胞微生物學(xué)分析Toll樣受體（Toll-like receptor, TLR）2和TLR4、胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Extracellular signal-regulated kinase, ERK）通路和核因子κB（Nuclear factor kB,NF-κB）信號通路在介導(dǎo)CHSPs誘生宿主細胞炎癥反應(yīng)中的作用。 研究目的 本研究試圖探討3種CHSPs在體外誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（Human umbilicalvein endothelial cells, HUVEC）分泌前炎癥細胞因子IL-6、IL-1β的功能，以及ERK信號通路與NF-κB信號通路在CHSPs誘生炎癥因子過程中的作用，初步研究TLR2、TLR4與CHSPs誘生炎癥因子及其炎癥信號通路之間的關(guān)聯(lián)，對進一步闡明Cpn的致病機制具有重要意義。 研究方法 從Genbank上獲得目的蛋白的全基因序列，通過分子生物學(xué)技術(shù)，設(shè)計并合成特異性引物，從制備的Cpn基因組模板上PCR擴增獲得目的基因全長，經(jīng)雙酶切后與pGEX-6p-2載體構(gòu)建成重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR、雙酶切、測序鑒定后進一步轉(zhuǎn)化E. coli XL1-Blue構(gòu)建原核表達重組體。在IPTG誘導(dǎo)下表達目的蛋白，Western-blot鑒定蛋白，以GST·BindTMResin或Ni-NTA親和層析純化目的蛋白，超濾管濃縮純化蛋白，并調(diào)整蛋白至1mg/mL的使用濃度。將該蛋白以polymyxinB agarose處理，或加入50μg/mL多粘菌素B于37℃孵育30min~1h去除內(nèi)毒素。 培養(yǎng)HUVEC，將上述獲得的無內(nèi)毒素的純化蛋白分別以0.5、1、5、10、15、20、30μg/mL的不同濃度刺激細胞，檢測HUVEC分泌炎癥因子IL-1β、IL-6的水平；并設(shè)2、6、12、24、36、48、60h不同的蛋白刺激時間，檢測HUVEC分泌IL-1β、IL-6的水平；將純化產(chǎn)物經(jīng)熱處理（56℃，20min或100℃，30min）或去蛋白處理后，，再與細胞孵育以檢測刺激物對細胞分泌炎癥因子的影響。 將3種CHSPs按2、15、30、45、60min的不同時間作用宿主細胞，收集細胞裂解液，并以抗磷酸化ERK及抗總ERK單抗檢測ERK通路的活化。設(shè)立LPS與Cpn陽性對照，觀察比較CHSPs與陽性對照激活ERK的方式；觀察比較3種CHSPs激活ERK的作用強弱；以ERK通路特異性抑制劑U0126預(yù)孵育細胞30min，CHSPs刺激后檢測ERK通路的活化狀態(tài)及炎癥因子的水平。 將3種CHSPs按30min，60min，120min的作用時間孵育宿主細胞，收獲細胞核蛋白提取物，與末端標記的核酸探針結(jié)合進行凝膠遷移滯后實驗（Electrophoretic Mobility ShiftAssay, EMSA）檢測，以PBS及GST蛋白為陰性對照，觀察比較3種CHSPs與陰性對照的結(jié)果，鑒定CHSPs是否能激活HUVEC誘導(dǎo)NF-κB分子活化、活化分子的作用特點以及活化作用的強弱；進一步用特異性抗p65單抗進行supershift實驗，驗證上述EMSA實驗核蛋白提取物中是否含有活化產(chǎn)物p65特異性抗原。以NF-κB通路特異性抑制劑PDTC預(yù)孵育細胞60min，CHSPs刺激后檢測NF-κB通路的活化狀態(tài)及炎癥因子的水平。以報告基因pNF-κB-luc轉(zhuǎn)染細胞，并設(shè)pRL-TK內(nèi)參，進一步證實CHSPs在刺激HUVEC后能否活化NF-κB分子進入細胞核，并與靶基因上特定的κ位點結(jié)合以調(diào)節(jié)報告基因轉(zhuǎn)錄。 以TLR2、TLR4、CD14、MD2分子根據(jù)實驗設(shè)計不轉(zhuǎn)染或單獨或共轉(zhuǎn)染人胚腎細胞（Human embryonic kidney cell）HEK293，用20μg/mL的CHSPs分別刺激，Western-blot檢測TLR2和/或TLR4在CHSPs激活ERK信號通路中的作用；同時，將這些分子按不同實驗?zāi)康呐cpNF-κB-luc與pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，熒光素酶報告基因檢測TLR2和/或TLR4在CHSPs激活NF-κB轉(zhuǎn)錄活性中的作用。 研究結(jié)果 以Cpn標準株AR-39基因組為模板擴增得到Chsp60和Chsp70的基因全長，并構(gòu)建了pGEX-6p-2的原核重組質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切、測序鑒定為CHSP60及CHSP70蛋白的基因序列；重組質(zhì)粒在E.coli XL1-blue中誘導(dǎo)表達出分子量約86kDa和98kDa的融合蛋白，且均以可溶性的方式存在，Western-blot檢測為GST標記的目的蛋白。復(fù)蘇CHSP10重組菌并誘導(dǎo)表達重組蛋白。分別用GST·BindTMResin及Ni-NTA親和層析純化獲得高純度的目的蛋白，經(jīng)超濾裝置可將目的蛋白濃縮至原濃度的幾十倍，調(diào)整后使工作蛋白濃度為1mg/mL，經(jīng)多粘菌素B處理可去除內(nèi)毒素。 CHSPs刺激宿主細胞分泌前炎癥因子的作用根據(jù)不同的蛋白劑量及不同刺激時間有所不同。CHSPs刺激HUVEC分泌IL-1β、IL-6的水平隨蛋白濃度的升高而呈上升趨勢，在濃度為0.5~30μg/mL的范圍內(nèi)，以30μg/mL的CHSPs誘生細胞分泌的炎癥因子水平最高；在2~60h的作用時間內(nèi)，隨刺激時間的延長，誘生炎癥因子的水平逐漸升高，CHSP10在刺激12h后誘生IL-1β、IL-6的量到達高峰，而CHSP60和CHSP70在刺激24h后誘生IL-1β、IL-6的量到達高峰，3種CHSPs相比，CHSP60誘生炎癥因子的能力最強，CHSP70次之，CHSP10最弱。 3種CHSPs刺激HUVEC后，Western-blot能檢測到明顯增強的磷酸化ERK分子，CHSP10在刺激15min時就可出現(xiàn)明顯的磷酸化蛋白條帶，經(jīng)bandscan掃描分析，其在30min磷酸化ERK達到峰值；CHSP60和CHSP70均在刺激30min時磷酸化ERK條帶出現(xiàn)高峰值，隨后逐漸降低；Cpn激活HUVEC的ERK通路也是在30min時達到峰值，其后下降。而LPS活化HUVEC的ERK通路則是在15min達到峰值。三種CHSPs相比，CHP60活化ERK通路的作用最強，20μg/mL濃度產(chǎn)生的效果僅比Cpn（MOI=0.5）的作用稍弱，CHSP10與CHSP70作用次之。用U0126預(yù)孵育后，Western-blot檢測到每組磷酸化ERK的量顯著降低，同時CHSPs刺激HUVEC分泌2種炎癥因子的水平也明顯減少。 3種CHSPs刺激HUVEC后，EMSA顯示，實驗組均出現(xiàn)蛋白與DNA結(jié)合的復(fù)合物遷移帶，且在30min，60min，120min的不同時間點，以蛋白作用60min時濃度最深，與陰性對照組相比有明顯區(qū)別；3組CHSPs相比，CHSP60的作用最強，20μg/mL濃度產(chǎn)生的效果與Cpn（MOI=0.5）的作用相當，CHSP70作用次之，CHSP10最弱。Supershift實驗顯示3組CHSPs中除了特異性蛋白/DNA復(fù)合物遷移帶外，均出現(xiàn)一條特異性的抗原抗體復(fù)合物超遷移帶。用PDTC預(yù)孵育細胞后，EMSA顯示蛋白/DNA復(fù)合物遷移帶明顯減弱甚至消失，同時，CHSPs刺激HUVEC分泌的IL-1β、IL-6的水平也明顯減少。熒光素酶報告基因檢測顯示，CHSPs可活化HUVEC的NF-κB分子。 以人TLR2、TLR4和CD14及MD2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，Western-blot顯示轉(zhuǎn)染TLR2和/或TLR4后的實驗組細胞經(jīng)CHSPs刺激后均可顯著上調(diào)磷酸化ERK的表達；以共轉(zhuǎn)染pNF-κB-luc、pRL-TK質(zhì)粒的報告基因來檢測TLR在介導(dǎo)NF-κB通路中的作用，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了TLR的實驗組，經(jīng)刺激后可顯著激活NF-κB信號通路，其中，共轉(zhuǎn)染2種受體的實驗組通路活化的程度要高于單項轉(zhuǎn)染組，在單項轉(zhuǎn)染組中，以TLR4介導(dǎo)激活NF-κB活化的作用強于TLR2。 結(jié)論 1.成功構(gòu)建了CHSP10、CHSP60、CHSP70的原核表達載體，經(jīng)誘導(dǎo)表達及純化后獲得了1mg/mL高純度的相對分子量分別為15kDa、86kDa、98kDa的可溶性純化蛋白； 2. CHSPs能在體外刺激HUVEC分泌炎癥因子IL-1β、IL-6，并呈現(xiàn)劑量依賴性與時間依賴性，說明CHSPs可能參與Cpn誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)； 3. CHSPs能通過活化HUVEC的ERK信號通路誘生炎癥因子； 4. CHSPs能通過活化HUVEC的NF-κB信號通路誘生炎癥因子； 5. TLR2與TLR4參與介導(dǎo)CHSPs激活ERK和NF-κB信號通路的過程。
【圖文】：

30Chsp60 基因的 PCR ion of hsp60 gene of C2:PCR product of hsp60 fro3:negative control;0 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及組質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖組質(zhì)粒的 PCR 及雙酶 pGEX-6p-2/hsp60 重兩個片段，一個約 4.9

1 2 320001000750bp 1-1 Cpn 感染 HEp-2 細胞的 IF 法檢測 (×1000g.1-1 IF analysis of HEp-2 cells infected with Cp cells uninfected with Cpn; B: HEp-2 cells infected with C0 編碼基因的 PCR 擴增 hsp60 引物，對提取的 Cpn 基因組模板進行 PCR發(fā)現(xiàn)擴增出一條特異性基因片段，且該片段與預(yù)。（圖 1-2）
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R374

【參考文獻】

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本文編號：2568468