【摘要】：流感病毒所造成的人員傷亡和經(jīng)濟(jì)損失在世界范圍內(nèi)提高了對(duì)其的關(guān)注程度,過(guò)去半個(gè)世紀(jì)所積累的相關(guān)研究資料為我們對(duì)抗流感病毒提供有力武器。流感病毒基因組結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單但變異速率非常快,每年都需要更新相應(yīng)的預(yù)防疫苗,這主要與病毒囊膜表面的兩種糖蛋白,血凝素(Hemagglutinin, HA)與神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase, NA)密切相關(guān)。這兩種糖蛋白在識(shí)別、進(jìn)入宿主細(xì)胞和增殖擴(kuò)散中扮演了重要的生物學(xué)角色。目前研究顯示流感病毒發(fā)生的糖基化僅為N-糖基化類型。為了研究N-糖基化在流感病毒糖蛋白中的分布規(guī)律,位點(diǎn)變化以及不同結(jié)構(gòu)特征的N-糖鏈對(duì)病毒囊膜糖蛋白功能和結(jié)合效率影響,本研究采用生物信息學(xué)方法展開討論。 在第一部分研究中,本課題收集并比對(duì)已報(bào)道的17種HA亞型與10種NA亞型氨基酸序列,通過(guò)分析糖基化位點(diǎn)的出現(xiàn)位置與保守率發(fā)現(xiàn)隨著樣本量的增加或跨種間傳播的產(chǎn)生,該亞型序列集會(huì)產(chǎn)生較多的糖基化位點(diǎn)。例如只含有禽流感H4亞型或H6亞型病毒HA的糖基化位點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于含有季節(jié)性人流感H1N1或H3N2病毒的相關(guān)序列集,而隨著294NSS糖基化位點(diǎn)的出現(xiàn)某些H3N2病毒的HA中甚至出現(xiàn)了多達(dá)11個(gè)糖基化位點(diǎn)數(shù)目。本研究根據(jù)保守性和出現(xiàn)位置推斷流感病毒糖蛋白中存在兩類糖基化位點(diǎn)：一類在各亞型序列中具有相同位置且高度保守,另一個(gè)則存在于各亞型內(nèi)部且保守率不一。位于HA0裂解位點(diǎn)附近(如H1序列中的27NNST或H8序列中30NGT)與HA2融膜肽附近的(如H1序列集中的498NGT或H5序列集中500NGS)糖基化位點(diǎn)在各亞型中高度保守,除參與宿主免疫系統(tǒng)逃避外還發(fā)揮著保護(hù)與調(diào)節(jié)HA0裂解位點(diǎn)與融膜肽等病毒基本生物學(xué)功能。此外位于HA1序列C-端即HA的頭莖結(jié)合部還存在一個(gè)除H7和H15亞型外在各亞型中高度保守的糖基化位點(diǎn)。每種亞型中還存在有3-10個(gè)不等的糖基化位點(diǎn),它們受到了所處不同進(jìn)化枝的影響,保守率從0.1%(如H3亞型中的294NSS(0.15%))到100%不等。值得一提某些高度保守的糖基化位點(diǎn)距離各亞型高度保守的半胱氨酸殘基較為接近,這可能與在穩(wěn)定新生蛋白折疊時(shí)二硫鍵形成需要N-糖鏈引導(dǎo)的鈣聯(lián)蛋白／鈣網(wǎng)蛋白復(fù)合體作用相關(guān)。NA莖部通常出現(xiàn)2至4個(gè)高度保守的糖化位點(diǎn),其它保守率不一的糖基化位點(diǎn)通常位于NA頭部的各種抗原位點(diǎn)附近。位于NA四聚體頭部頂端的146N糖基化位點(diǎn)的在各NA亞型中高度保守,有研究顯示其與病毒神經(jīng)毒力密切相關(guān)。如同對(duì)HA的描述,由于大量記錄的H1N1、H3N2、H5N1、H7N2以及H9N2病毒存在導(dǎo)致了N1與N2序列集中出現(xiàn)了多樣的糖基化位點(diǎn),尤其位于頭部區(qū)域,它們主要參與了免疫逃避。NA的糖基化位點(diǎn)數(shù)目受到莖部特異性序列缺失的影響。莖部序列的缺失有可能降低NA的酶活性并降低對(duì)臨近未感染細(xì)胞表面唾液酸糖鏈的切除能力從而增強(qiáng)子代病毒對(duì)臨近細(xì)胞的感染。除N4、N8與N9外,每種NA亞型都存在3至24個(gè)氨基酸與相應(yīng)1至4個(gè)不等的糖基化位點(diǎn)的缺失。有意思的即使亞型內(nèi)部特異性序列缺失還與與不同HA組合病毒來(lái)源有關(guān)。本節(jié)結(jié)果提供了全面而直觀的糖基化位點(diǎn)在流感病毒兩種糖蛋白各亞型之間的分布及相互關(guān)系。 本課題第二部分切入H5N1病毒,研究糖基化位點(diǎn)在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生于糖結(jié)合蛋白的HA與外切糖苷酶的NA中的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系。根據(jù)序列比對(duì)以及統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)其HA與NA各含有12個(gè)糖基化位點(diǎn),而最近五年中HA中糖基化位點(diǎn)逐漸增多并復(fù)雜化,而在NA中的影響逐漸降低。在2003年香港再次出現(xiàn)高致病性禽流感致人死亡前,大多數(shù)H5N1病毒均屬于clade0,HA與NA中不同糖基化位點(diǎn)模式共同存在。這個(gè)時(shí)期NA包含除極偶然出現(xiàn)的341NGT位點(diǎn)外位于莖部四個(gè)和頭部七個(gè)所有目前已知糖基化位點(diǎn),而HA則除五個(gè)高度保守的糖基化位點(diǎn)外還出現(xiàn)了170N與181N兩個(gè)位點(diǎn)。從2003年開始世衛(wèi)組織記錄到由三波H5N1病毒爆發(fā)造成的數(shù)百人死亡和巨大的經(jīng)濟(jì)損失,但是截至目前在除clade7外所有只感染禽的H5N1病毒進(jìn)化枝(即clade3、4、5、6、8和9)中其糖基化模式高度保守。2005年H5N1病毒中clade2.2進(jìn)化枝在青海湖附近造成上百只候鳥死亡后向西傳播并導(dǎo)致歐洲等地部分禽類死亡。2006年中,H5N1病毒首次出現(xiàn)在非洲大陸,繼而導(dǎo)致上百人死亡與禽鳥的大量捕殺。目前埃及等地最新出現(xiàn)的clade2.2.1.1進(jìn)化枝中其HA新增一個(gè)糖基化位點(diǎn)：88NVS。除clade2.2.1.1外大多數(shù)位于clade2.2中病毒普遍由于T172A的突變?nèi)笔?70N糖基化位點(diǎn)。據(jù)猜測(cè)170N的缺失可能會(huì)增強(qiáng)H5N1病毒HA對(duì)人呼吸道中常見唾液酸糖鏈的親和力,相比該進(jìn)化枝中NA糖基化位點(diǎn)迅速減少僅殘留3個(gè)。然而目前從中國(guó)和越南等地clade2.3.4進(jìn)化枝中病毒的糖基化位點(diǎn)模式在HA中保守,在NA中較為多變。相反另一大常見進(jìn)化枝clade2.3.2中以170N的缺失和NA中糖基化位點(diǎn)保守為特征。181N糖基化位點(diǎn)位于HA頂部β-折疊,在所有的人感染病毒中保守禽感染病毒中保守率較低。事實(shí)上,所有的181N糖基化位點(diǎn)缺失毒株僅從禽類宿主中分離得到,如clade7.1、7.2或2.2.1.1。這樣的結(jié)論為研究糖基化位點(diǎn)與宿主特異性的關(guān)系提供了啟示。 在第三部分中本課題通過(guò)三維模型構(gòu)建和分子動(dòng)力學(xué)模擬優(yōu)化研究糖基化HA與唾液酸糖鏈的動(dòng)力學(xué)變化特征。HA結(jié)合到宿主唾液酸糖鏈?zhǔn)荏w是感染過(guò)程的首要步驟,不同亞型中結(jié)合唾液酸糖鏈的受體結(jié)合域序列高度保守。而170N與181N位點(diǎn)均位于受體結(jié)合域附近,也可能參與或影響了受體識(shí)別過(guò)程。為了探索糖基化HA與SA-α-2,3-Gal/SA-α-2,6-Gal糖鏈的結(jié)合能力,本研究通過(guò)對(duì)不同程度糖基化HA分子進(jìn)行16ns分子動(dòng)力學(xué)模擬并采用多種動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析,發(fā)現(xiàn)N-糖鏈末端單糖殘基具有極高的RMSF (root-mean-square fluctuation),意味著N-糖鏈末端極為活躍。作為具有復(fù)雜構(gòu)象且高分子量的親水性分子,N-糖鏈與蛋白中僅由一個(gè)共價(jià)鍵相連,這說(shuō)明N-糖鏈的存在將影響HA受體結(jié)合能力。通過(guò)比較唾液酸糖鏈50ns水溶液分子動(dòng)力學(xué)模擬并間隔5ns進(jìn)行構(gòu)象采樣將其唾液酸殘基進(jìn)行疊加,發(fā)現(xiàn)兩類唾液酸具有不同的拓?fù)鋵W(xué)構(gòu)象,即SA-α-2,3-Gal唾液酸糖鏈其余部分向左而SA-α-2,6-Gal唾液酸糖鏈其余部分向右。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的HA和唾液酸糖鏈體系為隨后進(jìn)行的分子對(duì)接試驗(yàn)提供了研究材料。 第四部分中,本課題通過(guò)分子對(duì)接與三聚體HA-唾液酸糖鏈復(fù)合體分子動(dòng)力學(xué)模擬為判斷N-糖鏈在受體識(shí)別過(guò)程中的影響提供了直觀的結(jié)論：RBD附近的170N與181N位點(diǎn)的N-糖鏈所影響范圍極大而相應(yīng)的唾液酸糖鏈則主要局限于受體結(jié)合域附近。在自由或結(jié)合狀態(tài)下都可以了解SA-α-2,3-Gal唾液酸糖鏈具有線狀朝向HA外側(cè)的拓?fù)鋵W(xué)構(gòu)象,而SA-α-2,6-Gal唾液酸糖鏈則出現(xiàn)類似魚鉤狀的彎曲并朝向Helix200。利用在模擬過(guò)程中的容積分析法可以看出兩類唾液酸糖鏈獨(dú)特的拓?fù)錁?gòu)象與HA中不同位點(diǎn)的N-糖鏈相互影響從而造成HA對(duì)不同唾液酸糖鏈的結(jié)合差異：181N糖基化位點(diǎn)的缺失有利于結(jié)合線狀且朝外的SA-α-2,3-Gal唾液酸糖鏈,而170N糖基化位點(diǎn)的缺失則利于識(shí)別魚鉤狀且朝向HA軸心的SA-α-2,6-Gal唾液酸糖鏈。而當(dāng)糖基化程度更加復(fù)雜時(shí),適應(yīng)HA受體識(shí)別域的唾液酸糖鏈配體構(gòu)象將更加受到限制。 本課題的實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)論還可以推廣至流感病毒其它亞型HA受體結(jié)合域附近類似糖基化位點(diǎn)的研究。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)論有助于對(duì)疫苗設(shè)計(jì)、防控病毒擴(kuò)散和病毒毒力與糖基化位點(diǎn)關(guān)系的進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R373

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2 郇麗芳;姚立紅;陳愛s，

本文編號(hào)：2564879