【摘要】：流感病毒所造成的人員傷亡和經濟損失在世界范圍內提高了對其的關注程度,過去半個世紀所積累的相關研究資料為我們對抗流感病毒提供有力武器。流感病毒基因組結構相對簡單但變異速率非常快,每年都需要更新相應的預防疫苗,這主要與病毒囊膜表面的兩種糖蛋白,血凝素(Hemagglutinin, HA)與神經氨酸酶(Neuraminidase, NA)密切相關。這兩種糖蛋白在識別、進入宿主細胞和增殖擴散中扮演了重要的生物學角色。目前研究顯示流感病毒發(fā)生的糖基化僅為N-糖基化類型。為了研究N-糖基化在流感病毒糖蛋白中的分布規(guī)律,位點變化以及不同結構特征的N-糖鏈對病毒囊膜糖蛋白功能和結合效率影響,本研究采用生物信息學方法展開討論。 在第一部分研究中,本課題收集并比對已報道的17種HA亞型與10種NA亞型氨基酸序列,通過分析糖基化位點的出現(xiàn)位置與保守率發(fā)現(xiàn)隨著樣本量的增加或跨種間傳播的產生,該亞型序列集會產生較多的糖基化位點。例如只含有禽流感H4亞型或H6亞型病毒HA的糖基化位點遠遠少于含有季節(jié)性人流感H1N1或H3N2病毒的相關序列集,而隨著294NSS糖基化位點的出現(xiàn)某些H3N2病毒的HA中甚至出現(xiàn)了多達11個糖基化位點數目。本研究根據保守性和出現(xiàn)位置推斷流感病毒糖蛋白中存在兩類糖基化位點：一類在各亞型序列中具有相同位置且高度保守,另一個則存在于各亞型內部且保守率不一。位于HA0裂解位點附近(如H1序列中的27NNST或H8序列中30NGT)與HA2融膜肽附近的(如H1序列集中的498NGT或H5序列集中500NGS)糖基化位點在各亞型中高度保守,除參與宿主免疫系統(tǒng)逃避外還發(fā)揮著保護與調節(jié)HA0裂解位點與融膜肽等病毒基本生物學功能。此外位于HA1序列C-端即HA的頭莖結合部還存在一個除H7和H15亞型外在各亞型中高度保守的糖基化位點。每種亞型中還存在有3-10個不等的糖基化位點,它們受到了所處不同進化枝的影響,保守率從0.1%(如H3亞型中的294NSS(0.15%))到100%不等。值得一提某些高度保守的糖基化位點距離各亞型高度保守的半胱氨酸殘基較為接近,這可能與在穩(wěn)定新生蛋白折疊時二硫鍵形成需要N-糖鏈引導的鈣聯(lián)蛋白／鈣網蛋白復合體作用相關。NA莖部通常出現(xiàn)2至4個高度保守的糖化位點,其它保守率不一的糖基化位點通常位于NA頭部的各種抗原位點附近。位于NA四聚體頭部頂端的146N糖基化位點的在各NA亞型中高度保守,有研究顯示其與病毒神經毒力密切相關。如同對HA的描述,由于大量記錄的H1N1、H3N2、H5N1、H7N2以及H9N2病毒存在導致了N1與N2序列集中出現(xiàn)了多樣的糖基化位點,尤其位于頭部區(qū)域,它們主要參與了免疫逃避。NA的糖基化位點數目受到莖部特異性序列缺失的影響。莖部序列的缺失有可能降低NA的酶活性并降低對臨近未感染細胞表面唾液酸糖鏈的切除能力從而增強子代病毒對臨近細胞的感染。除N4、N8與N9外,每種NA亞型都存在3至24個氨基酸與相應1至4個不等的糖基化位點的缺失。有意思的即使亞型內部特異性序列缺失還與與不同HA組合病毒來源有關。本節(jié)結果提供了全面而直觀的糖基化位點在流感病毒兩種糖蛋白各亞型之間的分布及相互關系。 本課題第二部分切入H5N1病毒,研究糖基化位點在進化過程中發(fā)生于糖結合蛋白的HA與外切糖苷酶的NA中的動態(tài)平衡關系。根據序列比對以及統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)其HA與NA各含有12個糖基化位點,而最近五年中HA中糖基化位點逐漸增多并復雜化,而在NA中的影響逐漸降低。在2003年香港再次出現(xiàn)高致病性禽流感致人死亡前,大多數H5N1病毒均屬于clade0,HA與NA中不同糖基化位點模式共同存在。這個時期NA包含除極偶然出現(xiàn)的341NGT位點外位于莖部四個和頭部七個所有目前已知糖基化位點,而HA則除五個高度保守的糖基化位點外還出現(xiàn)了170N與181N兩個位點。從2003年開始世衛(wèi)組織記錄到由三波H5N1病毒爆發(fā)造成的數百人死亡和巨大的經濟損失,但是截至目前在除clade7外所有只感染禽的H5N1病毒進化枝(即clade3、4、5、6、8和9)中其糖基化模式高度保守。2005年H5N1病毒中clade2.2進化枝在青海湖附近造成上百只候鳥死亡后向西傳播并導致歐洲等地部分禽類死亡。2006年中,H5N1病毒首次出現(xiàn)在非洲大陸,繼而導致上百人死亡與禽鳥的大量捕殺。目前埃及等地最新出現(xiàn)的clade2.2.1.1進化枝中其HA新增一個糖基化位點：88NVS。除clade2.2.1.1外大多數位于clade2.2中病毒普遍由于T172A的突變缺失170N糖基化位點。據猜測170N的缺失可能會增強H5N1病毒HA對人呼吸道中常見唾液酸糖鏈的親和力,相比該進化枝中NA糖基化位點迅速減少僅殘留3個。然而目前從中國和越南等地clade2.3.4進化枝中病毒的糖基化位點模式在HA中保守,在NA中較為多變。相反另一大常見進化枝clade2.3.2中以170N的缺失和NA中糖基化位點保守為特征。181N糖基化位點位于HA頂部β-折疊,在所有的人感染病毒中保守禽感染病毒中保守率較低。事實上,所有的181N糖基化位點缺失毒株僅從禽類宿主中分離得到,如clade7.1、7.2或2.2.1.1。這樣的結論為研究糖基化位點與宿主特異性的關系提供了啟示。 在第三部分中本課題通過三維模型構建和分子動力學模擬優(yōu)化研究糖基化HA與唾液酸糖鏈的動力學變化特征。HA結合到宿主唾液酸糖鏈受體是感染過程的首要步驟,不同亞型中結合唾液酸糖鏈的受體結合域序列高度保守。而170N與181N位點均位于受體結合域附近,也可能參與或影響了受體識別過程。為了探索糖基化HA與SA-α-2,3-Gal/SA-α-2,6-Gal糖鏈的結合能力,本研究通過對不同程度糖基化HA分子進行16ns分子動力學模擬并采用多種動力學參數分析,發(fā)現(xiàn)N-糖鏈末端單糖殘基具有極高的RMSF (root-mean-square fluctuation),意味著N-糖鏈末端極為活躍。作為具有復雜構象且高分子量的親水性分子,N-糖鏈與蛋白中僅由一個共價鍵相連,這說明N-糖鏈的存在將影響HA受體結合能力。通過比較唾液酸糖鏈50ns水溶液分子動力學模擬并間隔5ns進行構象采樣將其唾液酸殘基進行疊加,發(fā)現(xiàn)兩類唾液酸具有不同的拓撲學構象,即SA-α-2,3-Gal唾液酸糖鏈其余部分向左而SA-α-2,6-Gal唾液酸糖鏈其余部分向右。經過優(yōu)化的HA和唾液酸糖鏈體系為隨后進行的分子對接試驗提供了研究材料。 第四部分中,本課題通過分子對接與三聚體HA-唾液酸糖鏈復合體分子動力學模擬為判斷N-糖鏈在受體識別過程中的影響提供了直觀的結論：RBD附近的170N與181N位點的N-糖鏈所影響范圍極大而相應的唾液酸糖鏈則主要局限于受體結合域附近。在自由或結合狀態(tài)下都可以了解SA-α-2,3-Gal唾液酸糖鏈具有線狀朝向HA外側的拓撲學構象,而SA-α-2,6-Gal唾液酸糖鏈則出現(xiàn)類似魚鉤狀的彎曲并朝向Helix200。利用在模擬過程中的容積分析法可以看出兩類唾液酸糖鏈獨特的拓撲構象與HA中不同位點的N-糖鏈相互影響從而造成HA對不同唾液酸糖鏈的結合差異：181N糖基化位點的缺失有利于結合線狀且朝外的SA-α-2,3-Gal唾液酸糖鏈,而170N糖基化位點的缺失則利于識別魚鉤狀且朝向HA軸心的SA-α-2,6-Gal唾液酸糖鏈。而當糖基化程度更加復雜時,適應HA受體識別域的唾液酸糖鏈配體構象將更加受到限制。 本課題的實驗方法和結論還可以推廣至流感病毒其它亞型HA受體結合域附近類似糖基化位點的研究。因此本實驗結論有助于對疫苗設計、防控病毒擴散和病毒毒力與糖基化位點關系的進一步研究。
【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R373

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本文編號：2564879