【摘要】：第一部分低頻超聲聯(lián)合鹽酸氨溴索對表葡葡萄球菌生物被膜殺菌效果的研究 【目的】建立聚乙烯材料表面表皮葡萄球菌（Staphylococcusepidermidis）生物被膜（biofilm, BF）的體外模型，聯(lián)合低頻超聲和鹽酸氨溴索作用于成熟BF，定量分析低頻超聲增強鹽酸氨溴索對表皮葡萄球菌BF的殺菌效果。 【方法】于聚乙烯材料表面建立S. epidermidis RP62A菌株的成熟BF模型，利用快速銀染法觀察和鑒定BF結(jié)構(gòu)。分為7組，空白對照組，單獨低頻超聲干預(yù)組，單獨鹽酸氨溴索（濃度0.938、1.875mg/ml）干預(yù)組，鹽酸氨溴索（濃度0.938、1.875mg/ml）+低頻超聲1h組，鹽酸氨溴索（1.875mg/ml）+低頻超聲0.5h組，空白對照組只加TSB培養(yǎng)基，低頻超聲作用1h，鹽酸氨溴索作用24h。分組干預(yù)后，，利用二甲氧唑黃比色法（XTT）結(jié)合BF內(nèi)的活菌，結(jié)合多功能酶標儀測定吸光值，定量分析比較各不同干預(yù)組BF中細菌活力變化。 【結(jié)果】 RP62A菌株成熟BF快速銀染后，于光學(xué)顯微鏡下可見成熟BF結(jié)構(gòu)，細菌成團黏附聚集，以絲狀胞外多糖EPS之間相互聯(lián)結(jié)。XTT法結(jié)果顯示空白對照組、單獨低頻超聲作用組OD_(450)值分別為1.895±0.146、1.932±0.077(P0.05）；單獨鹽酸氨溴索作用組，隨著氨溴索濃度的增加，OD_(450)值呈現(xiàn)下降趨勢，表示BF內(nèi)被檢出的具有活性的細菌逐漸下降，在氨溴索濃度達到1.875mg/ml時，OD_(450)值為0.472±0.056，與空白對照組（1.895±0.146）相比，P0.05；鹽酸氨溴索（濃度1.875mg/ml）聯(lián)合不同作用時間（0.5h和1h）低頻超聲組OD_(450)值分別為0.104±0.052、0.064±0.048，與單獨鹽酸氨溴索（濃度1.875mg/ml）作用組相比P0.05，組間相比，P0.05。 【結(jié)論】單獨低頻超聲對表皮葡萄球菌BF無清除作用，鹽酸氨溴索濃度達到1.875mg/ml時，能明顯殺滅成熟表皮葡萄球菌BF內(nèi)的細菌，達到清除BF的效果，低頻超聲能明顯促進鹽酸氨溴索對BF的作用，且聯(lián)合低頻超聲作用1h和0.5h組之間相比效果無明顯差異。 第二部分低頻超聲聯(lián)合鹽酸氨溴索對表葡葡萄球菌生物被膜結(jié)構(gòu)的影響 【目的】體外聚乙烯材料建立成熟表皮葡萄球菌BF，利用低頻超聲聯(lián)合鹽酸氨溴索進行干預(yù)，驗證低頻超聲能夠促進鹽酸氨溴索的效果，增強其對BF結(jié)構(gòu)的的破壞作用。 【方法】建立聚乙烯材料表面的表皮葡萄球菌成熟BF體外模型，分為5組，空白對照組，單獨低頻超聲作用組，單獨鹽酸氨溴索（濃度1.875mg/ml）作用24h組，鹽酸氨溴索（濃度1.875mg/ml）作用24h+低頻超聲作用1h組，鹽酸氨溴索（濃度1.875mg/ml）作用24h+低頻超聲0.5h組，SYT09/PI對BF內(nèi)細菌熒光染色后，于共聚焦激光掃描顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM)觀察，利用圖像結(jié)構(gòu)分析軟件(Image Structure Analyzer，ISA)對各不同干預(yù)組BF圖像進行結(jié)構(gòu)參數(shù)的定量分析，了解低頻超聲聯(lián)合鹽酸氨溴索對表皮葡萄球菌BF結(jié)構(gòu)的影響；利用掃描電子顯微鏡(Scanning ElectronMicroscope，SEM)比較各不同干預(yù)組BF結(jié)構(gòu)的變化。 【結(jié)果】 CLSM掃描結(jié)果顯示單獨低頻超聲作用組紅綠熒光分布和強度和空白對照組無明顯差異，以綠色熒光（活菌）為主；單獨氨溴索（濃度1.875mg／ml）作用組紅色熒光信號（死菌）明顯增加，綠色熒光信號（活菌）分別和強度有減少，低頻超聲（1h,0.5h）能明顯促進氨溴索對BF的清除作用，以紅色信號為主，滿布視野，僅少許散在分別綠色信號。結(jié)合ISA軟件定量分析各不同干預(yù)組BF結(jié)構(gòu)參數(shù)的區(qū)別，單獨氨溴索（濃度1.875mg／ml）作用組和空白對照組相比，BF厚度分別為（15.45±2.48）μm和（25.25±3.39）μm, P0.05；平均擴散距離(average diffusion distance，ADD)分別為2.02±0.06和2.61±0.34,P0.05;結(jié)構(gòu)熵(textual entropy， TE)分別為7.19±0.19和7.88±0.09,P0.05;區(qū)域孔率(areal porosity，AP)分別為0.75±0.09和0.65±0.03，P0.05。鹽酸氨溴索（濃度1.875mg／ml）聯(lián)合低頻超聲（1h,0.5h）作用組的厚度（6.26±0.99，7.04±1.31）μm、AP分別為（0.90±0.01，0.85±0.03）、ADD分別為（1.53±0.03，1.52±0.05）、TE分別（5.68±0.07，5.82±0.52），與單獨氨溴索（濃度1.875mg／ml）作用組相比，P0.05。SEM顯示，空白對照組與單獨氨溴索作用組BF清除效果不明顯，仍可見大量BF，低頻超聲聯(lián)合氨溴索作用的兩組可見BF被破壞明顯，原本復(fù)雜的立體三維結(jié)構(gòu)變得層數(shù)明顯減少，BF內(nèi)部的相互黏附和聚集的聯(lián)系被破壞，間隙增大，變得松散，大部分細菌都是以游離狀態(tài)黏附于聚乙烯片表面。 【結(jié)論】低頻超聲能夠明顯促進氨溴索（濃度1.875mg/ml）對表皮葡萄球菌BF的清除作用，使得BF的結(jié)構(gòu)變得簡單稀疏。 第三部分低頻超聲聯(lián)合鹽酸氨溴索對表葡葡萄球菌生物被膜胞外多糖的作用 【目的】通過建立成熟表皮葡萄球菌BF模型，驗證低頻超聲能夠促進鹽酸氨溴索對BF胞外多糖的作用。 【方法】建立聚乙烯材料表面表皮葡萄球菌成熟BF模型，分為5組，空白對照組，單獨低頻超聲作用組，單獨鹽酸氨溴索（濃度1.875mg/ml）作用24h組，鹽酸氨溴索（濃度1.875mg/ml）作用24h+低頻超聲作用1h組，鹽酸氨溴索（濃度1.875mg/ml）作用24h+低頻超聲0.5h組，利用FITC-ConA對BF胞外多糖進行染色；于熒光顯微鏡下觀察比較不同干預(yù)組熒光信號的強度和分布的區(qū)別，驗證低頻超聲能夠增強氨溴索對S epidermidis BF胞外多糖的作用。 【結(jié)果】熒光染色結(jié)果顯示，胞外多糖被FITC-ConA染色后呈綠色熒光，并包繞在細菌周圍，呈云絮狀分布，單獨氨溴索（濃度1.875mg/ml）作用組較空白對照組，能有效清除包繞在BF外的胞外多糖，綠色信號減弱，云絮狀物質(zhì)減少，而低頻超聲能明顯促進氨溴索對胞外多糖的作用，使得顯微鏡下僅觀察到少許點狀熒光信號。 【結(jié)論】低頻超聲能夠明顯促進氨溴索（濃度1.875mg/ml）對表皮葡萄球菌BF胞外多糖的作用，使得BF結(jié)構(gòu)變得疏松。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R378.11

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊華;余加林;劉官信;李祿全;;氨溴索對銅綠假單胞菌生物膜早期黏附及胞外多糖的影響[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2008年02期

本文編號：2563650