發(fā)布時(shí)間：2019-11-16 10:10

【摘要】：研究背景 生殖支原體（Mycoplasma genitalium, Mg）是近年新明確的一種性病病原體，研究表明，Mg可能引起泌尿生殖道感染，與盆腔炎、呼吸道感染、關(guān)節(jié)炎等疾病有關(guān)，并可導(dǎo)致不育。另外，Mg還是引起艾滋病患者發(fā)生機(jī)會(huì)感染的主要病原體之一，被稱(chēng)為AIDS相關(guān)支原體。 對(duì)于Mg的感染，目前仍然沒(méi)有滿(mǎn)足臨床需要的疫苗可供使用，臨床上急需安全、有效的疫苗以用于預(yù)防Mg的感染。生殖支原體粘附素蛋白（MgPa）是位于其尖形結(jié)構(gòu)的一種主要的粘附素，其C端具有很強(qiáng)的免疫原性（最強(qiáng)區(qū)位于第1248～1364aa）。因此，MgPa是一種重要的中和抗原，在Mg的診斷和預(yù)防中起著重要的作用。本研究擬利用噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)篩選MgPa的模擬表位，采用多抗原肽（MAP）的設(shè)計(jì)方案，制備并純化含有模擬表位的八分枝MAP，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行研究。 研究目的 表達(dá)并純化含生殖支原體MgPa優(yōu)勢(shì)表位（1075～1364aa的重組蛋白（rMgPa），制備并純化rMgPa的多克隆抗體（pAb），以此pAb為靶分子，利用噬菌體展示隨機(jī)12肽庫(kù)篩選并鑒定MgPa的模擬表位，為研究MgPa的抗原表位結(jié)構(gòu)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；制備含有多個(gè)模擬表位的多抗原肽（MAP），檢測(cè)其誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，為研制安全、有效的基于多個(gè)抗原表位的Mg表位肽疫苗奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究方法 （1）利用構(gòu)建好的原核表達(dá)載體PET-30a(+)/MgPa在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)MgPa的重組蛋白，并用ELISA、SDA-PAGE和Western blot等方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，再用Ni-NAT親和層析柱純化重組蛋白，用BCA法測(cè)定重組蛋白的濃度。 （2）將經(jīng)純化的重組蛋白免疫新西蘭兔以制備其相應(yīng)的pAb，用飽和硫酸銨法和溴化氰活化的瓊脂糖4B親和層析柱純化pAb，用間接ELISA法檢測(cè)免疫兔血清中pAb的效價(jià)，再用Western blot鑒定pAb的特異性和免疫原性。 （3）以此pAb為靶分子對(duì)噬菌體展示隨機(jī)12肽庫(kù)進(jìn)行4輪生物淘洗，隨機(jī)挑取經(jīng)淘洗后的噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，提取并純化其單鏈DNA進(jìn)行DNA測(cè)序分析，，推導(dǎo)出噬菌體表面展示的外源性氨基酸序列，并用MIMOX工具進(jìn)行生物信息學(xué)分析。用ELISA、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)和Western blot等方法檢測(cè)噬菌體與pAb結(jié)合的特異性。 （4）以多聚賴(lài)氨酸為核心基質(zhì)，人工合成含有篩選到的模擬表位的八分枝MAP，用反向高效液相色譜（RP-HPLC）分析MAP的純度，再用質(zhì)譜分析儀測(cè)定MAP的分子量以期對(duì)其進(jìn)行鑒定。 （5）將30只6～8周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為PBS組、WP組、AS組、KH組和混合組，將100L PBS或100g各種合成的MAP或其混合物分別經(jīng)皮下多點(diǎn)注射免疫小鼠，共免疫4次，每間隔2w免疫1次。每次于免疫前1天剪尾取血，末次免疫后第14d摘眼球放血收集小鼠血清，無(wú)菌制備脾細(xì)胞懸液。 （6）間接ELISA測(cè)定小鼠血清中的特異性IgG抗體及其亞類(lèi)的水平；ELISA檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-4和IFN-γ水平；MTT比色法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)。 研究結(jié)果 （1）SDS-PAGE顯示，IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化有PET-30a(+)／MgPa的大腸桿菌成功表達(dá)了一分子量約為37kD的含6×His的融合蛋白rMgPa，經(jīng)Ni-NAT親和純化獲得了較高純度的目的蛋白，目的蛋白在菌體內(nèi)主要以包涵體形式存在，BCA法測(cè)定經(jīng)純化的目的蛋白濃度達(dá)到1160μg/mL。 （2）利用純化的經(jīng)復(fù)性后的rMgPa免疫新西蘭兔后獲得了相應(yīng)的pAb，間接ELISA結(jié)果顯示血清中特異性pAb的效價(jià)為1∶25600；Western blot的結(jié)果表明rMgPa能與免疫血清發(fā)生特異性結(jié)合；免疫血清經(jīng)飽和硫酸銨法初步純化，隨后經(jīng)親和層析法純化后得到具有較高純度的抗rMgPa的pAb，SDS-PAGE分析的結(jié)果表明所制備的pAb的輕鏈分子量約為25kD，重鏈分子量約為50kD，因此，該pAb的分子量約為150kD。 （3）以經(jīng)純化的抗rMgPa的pAb抗體為靶分子，對(duì)噬菌體展示隨機(jī)12肽庫(kù)進(jìn)行了4輪生物淘洗，第一輪和第四輪生物淘洗的產(chǎn)率分別為1.45×10-6和9.25×10-4，說(shuō)明特異性噬菌體克隆得到了明顯富集；經(jīng)對(duì)45種不同的肽序列進(jìn)行比較分析以及用MIMOX進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明45個(gè)肽序列中的3組一致性的核心序列分別為： P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P,A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I。 （4）ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：45個(gè)含不同肽序列的噬菌體克隆中，共有36個(gè)為陽(yáng)性噬菌體克隆，其中23個(gè)噬菌體克隆有較高的結(jié)合力，其A450值均高于1.5；競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果表明，這些噬菌體與pAb的特異性結(jié)合能被不同濃度的rMgPa部分抑制，且隨著其濃度的增加其抑制效果也相應(yīng)的增加；Western blot方法檢測(cè)的結(jié)果表明A450值高于1.5的23個(gè)陽(yáng)性噬菌體能與pAb發(fā)生特異性結(jié)合。 （5）反向高效液相色譜分析的結(jié)果表明合成的3個(gè)MAP的純度都在90%以上，質(zhì)譜分析的結(jié)果說(shuō)明所合成的MAP的分子量與預(yù)期的理論分子量基本一致，因此，成功地合成了較高純度的3個(gè)模擬表位的MAP。 （6）小鼠經(jīng)4次免疫后，WP組、AS組、KH組和混合免疫組血清中IgG抗體的A450值分別為0.935±0.028、0.640±0.022、0.841±0.103和1.326±0.025，與PBS對(duì)照組（0.118±0.023）比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.01）；與WP組、AS組和KH組相比，混合免疫組小鼠血清中IgG抗體的A450值升高更為明顯（p0.05）。 （7）WP組、AS組、KH組和混合免疫組的IgG抗體效價(jià)分別為1∶2560、1∶640、1∶2560和1∶5120。WP組、AS組、KH組和混合免疫組小鼠血清中的IgG抗體以IgG2a型為主，其相應(yīng)的IgG2a/IgG1分別為1.835±0.125、1.708±0.180、1.690±0.202和2.095±0.179，均顯著高于PBS組（0.967±0.142）（p0.01）。 （8）WP組、AS組、KH組和混合組的IL-4含量分別為55.588±2.407、42.996±1.935、54.754±2.270和81.598±2.649pg/mL，與PBS組（16.673±1.662）相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.01）。與WP、AS、KH組相比，混合組產(chǎn)生的IL-4水平具有顯著性差異（p＜0.01）。 （9）WP組、AS組、KH組和混合免疫組的刺激指數(shù)（SI）分別為1.560±0.036、1.353±0.131、1.424±0.041和1.874±0.060，明顯高于PBS組（1.107±0.032，p0.01）；混合免疫組的刺激指數(shù)（SI）顯著高于WP組、AS組和KH組（p0.01）。 （10）WP組、AS組、KH組和混合免疫組的IFN-γ含量分別為168.496±7.919、98.327±5.030、111.437±5.243和235.815±8.430pg/mL，顯著高于PBS組（31.476±1.717，p0.01）；且與WP組、AS組、KH組相比，混合免疫組的脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生了更多的IFN-γ（p0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 （1）成功表達(dá)并純化了分子量為37kD的重組蛋白rMgPa； （2）成功制備并純化了高效價(jià)、高特異性的兔抗rMgPa的pAb； （3）成功篩選到MgPa的3個(gè)可能的模擬表位：P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P,A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I； （4）成功制備并純化了3個(gè)模擬表位相應(yīng)的MAP——WP、AS和KH； （5）WP、AS和KH均能刺激小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，且混合免疫組誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答效果比單個(gè)MAP組更好。
【圖文】：

PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電 of PCR product by agarosewas identificated by PCR as used for template and the spe was performed as described inntrol.BLAST分析養(yǎng)物的 DNA 測(cè)序圖譜見(jiàn)所示，說(shuō)明所測(cè)的DNA序達(dá)

SDS-PAGE分析rMgPa的表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R375

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2561785