【摘要】：研究背景 生殖支原體（Mycoplasma genitalium, Mg）是近年新明確的一種性病病原體，研究表明，Mg可能引起泌尿生殖道感染，與盆腔炎、呼吸道感染、關(guān)節(jié)炎等疾病有關(guān)，并可導(dǎo)致不育。另外，Mg還是引起艾滋病患者發(fā)生機會感染的主要病原體之一，被稱為AIDS相關(guān)支原體。 對于Mg的感染，目前仍然沒有滿足臨床需要的疫苗可供使用，臨床上急需安全、有效的疫苗以用于預(yù)防Mg的感染。生殖支原體粘附素蛋白（MgPa）是位于其尖形結(jié)構(gòu)的一種主要的粘附素，其C端具有很強的免疫原性（最強區(qū)位于第1248～1364aa）。因此，MgPa是一種重要的中和抗原，在Mg的診斷和預(yù)防中起著重要的作用。本研究擬利用噬菌體展示隨機肽庫技術(shù)篩選MgPa的模擬表位，采用多抗原肽（MAP）的設(shè)計方案，制備并純化含有模擬表位的八分枝MAP，并對其免疫原性進行研究。 研究目的 表達并純化含生殖支原體MgPa優(yōu)勢表位（1075～1364aa的重組蛋白（rMgPa），制備并純化rMgPa的多克隆抗體（pAb），以此pAb為靶分子，利用噬菌體展示隨機12肽庫篩選并鑒定MgPa的模擬表位，為研究MgPa的抗原表位結(jié)構(gòu)提供實驗依據(jù)；制備含有多個模擬表位的多抗原肽（MAP），檢測其誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫和細胞免疫應(yīng)答水平，為研制安全、有效的基于多個抗原表位的Mg表位肽疫苗奠定實驗基礎(chǔ)。 研究方法 （1）利用構(gòu)建好的原核表達載體PET-30a(+)/MgPa在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達MgPa的重組蛋白，并用ELISA、SDA-PAGE和Western blot等方法對其進行鑒定，再用Ni-NAT親和層析柱純化重組蛋白，用BCA法測定重組蛋白的濃度。 （2）將經(jīng)純化的重組蛋白免疫新西蘭兔以制備其相應(yīng)的pAb，用飽和硫酸銨法和溴化氰活化的瓊脂糖4B親和層析柱純化pAb，用間接ELISA法檢測免疫兔血清中pAb的效價，再用Western blot鑒定pAb的特異性和免疫原性。 （3）以此pAb為靶分子對噬菌體展示隨機12肽庫進行4輪生物淘洗，隨機挑取經(jīng)淘洗后的噬菌體克隆進行擴增培養(yǎng)，提取并純化其單鏈DNA進行DNA測序分析，，推導(dǎo)出噬菌體表面展示的外源性氨基酸序列，并用MIMOX工具進行生物信息學(xué)分析。用ELISA、競爭性結(jié)合試驗和Western blot等方法檢測噬菌體與pAb結(jié)合的特異性。 （4）以多聚賴氨酸為核心基質(zhì)，人工合成含有篩選到的模擬表位的八分枝MAP，用反向高效液相色譜（RP-HPLC）分析MAP的純度，再用質(zhì)譜分析儀測定MAP的分子量以期對其進行鑒定。 （5）將30只6～8周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為PBS組、WP組、AS組、KH組和混合組，將100L PBS或100g各種合成的MAP或其混合物分別經(jīng)皮下多點注射免疫小鼠，共免疫4次，每間隔2w免疫1次。每次于免疫前1天剪尾取血，末次免疫后第14d摘眼球放血收集小鼠血清，無菌制備脾細胞懸液。 （6）間接ELISA測定小鼠血清中的特異性IgG抗體及其亞類的水平；ELISA檢測脾細胞培養(yǎng)上清中的IL-4和IFN-γ水平；MTT比色法檢測小鼠脾淋巴細胞的增殖反應(yīng)。 研究結(jié)果 （1）SDS-PAGE顯示，IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化有PET-30a(+)／MgPa的大腸桿菌成功表達了一分子量約為37kD的含6×His的融合蛋白rMgPa，經(jīng)Ni-NAT親和純化獲得了較高純度的目的蛋白，目的蛋白在菌體內(nèi)主要以包涵體形式存在，BCA法測定經(jīng)純化的目的蛋白濃度達到1160μg/mL。 （2）利用純化的經(jīng)復(fù)性后的rMgPa免疫新西蘭兔后獲得了相應(yīng)的pAb，間接ELISA結(jié)果顯示血清中特異性pAb的效價為1∶25600；Western blot的結(jié)果表明rMgPa能與免疫血清發(fā)生特異性結(jié)合；免疫血清經(jīng)飽和硫酸銨法初步純化，隨后經(jīng)親和層析法純化后得到具有較高純度的抗rMgPa的pAb，SDS-PAGE分析的結(jié)果表明所制備的pAb的輕鏈分子量約為25kD，重鏈分子量約為50kD，因此，該pAb的分子量約為150kD。 （3）以經(jīng)純化的抗rMgPa的pAb抗體為靶分子，對噬菌體展示隨機12肽庫進行了4輪生物淘洗，第一輪和第四輪生物淘洗的產(chǎn)率分別為1.45×10-6和9.25×10-4，說明特異性噬菌體克隆得到了明顯富集；經(jīng)對45種不同的肽序列進行比較分析以及用MIMOX進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明45個肽序列中的3組一致性的核心序列分別為： P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P,A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I。 （4）ELISA實驗的結(jié)果顯示：45個含不同肽序列的噬菌體克隆中，共有36個為陽性噬菌體克隆，其中23個噬菌體克隆有較高的結(jié)合力，其A450值均高于1.5；競爭性結(jié)合試驗的結(jié)果表明，這些噬菌體與pAb的特異性結(jié)合能被不同濃度的rMgPa部分抑制，且隨著其濃度的增加其抑制效果也相應(yīng)的增加；Western blot方法檢測的結(jié)果表明A450值高于1.5的23個陽性噬菌體能與pAb發(fā)生特異性結(jié)合。 （5）反向高效液相色譜分析的結(jié)果表明合成的3個MAP的純度都在90%以上，質(zhì)譜分析的結(jié)果說明所合成的MAP的分子量與預(yù)期的理論分子量基本一致，因此，成功地合成了較高純度的3個模擬表位的MAP。 （6）小鼠經(jīng)4次免疫后，WP組、AS組、KH組和混合免疫組血清中IgG抗體的A450值分別為0.935±0.028、0.640±0.022、0.841±0.103和1.326±0.025，與PBS對照組（0.118±0.023）比較，均具有統(tǒng)計學(xué)意義（p0.01）；與WP組、AS組和KH組相比，混合免疫組小鼠血清中IgG抗體的A450值升高更為明顯（p0.05）。 （7）WP組、AS組、KH組和混合免疫組的IgG抗體效價分別為1∶2560、1∶640、1∶2560和1∶5120。WP組、AS組、KH組和混合免疫組小鼠血清中的IgG抗體以IgG2a型為主，其相應(yīng)的IgG2a/IgG1分別為1.835±0.125、1.708±0.180、1.690±0.202和2.095±0.179，均顯著高于PBS組（0.967±0.142）（p0.01）。 （8）WP組、AS組、KH組和混合組的IL-4含量分別為55.588±2.407、42.996±1.935、54.754±2.270和81.598±2.649pg/mL，與PBS組（16.673±1.662）相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義（p0.01）。與WP、AS、KH組相比，混合組產(chǎn)生的IL-4水平具有顯著性差異（p＜0.01）。 （9）WP組、AS組、KH組和混合免疫組的刺激指數(shù)（SI）分別為1.560±0.036、1.353±0.131、1.424±0.041和1.874±0.060，明顯高于PBS組（1.107±0.032，p0.01）；混合免疫組的刺激指數(shù)（SI）顯著高于WP組、AS組和KH組（p0.01）。 （10）WP組、AS組、KH組和混合免疫組的IFN-γ含量分別為168.496±7.919、98.327±5.030、111.437±5.243和235.815±8.430pg/mL，顯著高于PBS組（31.476±1.717，p0.01）；且與WP組、AS組、KH組相比，混合免疫組的脾淋巴細胞產(chǎn)生了更多的IFN-γ（p0.01），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論 （1）成功表達并純化了分子量為37kD的重組蛋白rMgPa； （2）成功制備并純化了高效價、高特異性的兔抗rMgPa的pAb； （3）成功篩選到MgPa的3個可能的模擬表位：P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P,A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I； （4）成功制備并純化了3個模擬表位相應(yīng)的MAP——WP、AS和KH； （5）WP、AS和KH均能刺激小鼠產(chǎn)生較強的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答，且混合免疫組誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答效果比單個MAP組更好。
【圖文】：

PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電 of PCR product by agarosewas identificated by PCR as used for template and the spe was performed as described inntrol.BLAST分析養(yǎng)物的 DNA 測序圖譜見所示，說明所測的DNA序達

SDS-PAGE分析rMgPa的表達
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R375

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李曉慧;唐亮;劉崠;孫紅梅;周彩存;談立松;王麗萍;張培德;張尚權(quán);;異種血管內(nèi)皮生長因子基因重組T7噬菌體疫苗對小鼠Lewis肺癌的抑制作用[J];癌癥;2006年10期

2 吳玉章,劉茂昌,賈正才,鄒麗云;HBV新型免疫原的設(shè)計、合成及免疫原性研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2000年10期

3 唐正宇;吳移謀;余敏君;;生殖支原體MgPa原核載體的構(gòu)建[J];醫(yī)學(xué)臨床研究;2008年06期

4 陳鶴,陳福,趙悅;利用噬菌體肽庫技術(shù)進行抗原中和位點的鑒定[J];哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2000年04期

5 吳玉章,朱錫華;A new approach for B-cell epitope prediction in viral proteins[J];Chinese Science Bulletin;1995年09期

6 王穎,田海軍,秦莉,朱梅,陳應(yīng)華;Three Candidate Peptide-Vaccines in Combination To Induce High Levels of Multiantibodies Against HIV-1[J];Tsinghua Science and Technology;2001年03期

7 朱錫華,吳玉章;對表位生物學(xué)研究的認(rèn)識和體會[J];上海免疫學(xué)雜志;1998年01期

8 楊華;馮勤;徐慧玉;壽成超;;應(yīng)用噬菌體肽庫技術(shù)獲得與豬鼻支原體蛋白P37結(jié)合的多肽序列[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2011年06期

9 吳健敏,任兆鈞,余興龍,涂長春,張念祖;利用T4噬菌體展示豬瘟病毒E2抗原[J];中國生物工程雜志;2004年11期

10 劉志剛,俞煒源,林建波;新型噬菌體表面呈現(xiàn)載體的構(gòu)建[J];生物技術(shù)通訊;2002年01期

本文編號：2561785