【摘要】：近年來(lái),組織工程皮膚的發(fā)展取得了很大的進(jìn)展,有不少組織工程皮膚替代物已經(jīng)應(yīng)用于臨床并取得了一定的修復(fù)創(chuàng)面的效果。許多學(xué)者認(rèn)為干細(xì)胞在組織工程皮膚修復(fù)創(chuàng)面的過(guò)程中取到了很重要的作用,目前已有學(xué)者采用出成體干細(xì)胞如脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMCs),表皮干細(xì)胞(ESCs)作為組織工程種子細(xì)胞,構(gòu)建組織工程皮膚并用于修復(fù)創(chuàng)面缺損,取得了比普通的皮膚細(xì)胞更好的修復(fù)效果。但是構(gòu)建組織工程皮膚需要大量的種子細(xì)胞,上述細(xì)胞的來(lái)源和數(shù)量是制約含干細(xì)胞的組織工程皮膚產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化臨床應(yīng)用的主要障礙之一。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)羊膜細(xì)胞具有干細(xì)胞特性,理論上可以分化成各種組織細(xì)胞,它的這些特點(diǎn)使其作為其他干細(xì)胞的替代物而引起廣泛的關(guān)注。 從羊膜分離培養(yǎng)的細(xì)胞包括羊膜間充質(zhì)細(xì)胞( Human amniotic mesenchymal cells,HAMCs)和羊膜上皮細(xì)胞(Human amniotic epithelial cells,HAECs),研究證明從羊膜來(lái)源的細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物并且具有分化成三個(gè)胚層細(xì)胞的能力。羊膜上皮細(xì)胞的表面標(biāo)志物如CD29、CD105、CD73、胚胎表面抗原(SSEA)3和4、腫瘤抑制抗原1-60、1-81(TRA 1-60、TRA 1-81)陽(yáng)性表達(dá),而SSEA-1、CD34和CD133等是陰性表達(dá),除了細(xì)胞表面抗原,羊膜上皮細(xì)胞還表達(dá)多能干細(xì)胞的分子標(biāo)志物,比如轉(zhuǎn)錄結(jié)合蛋白4(OCT-4)和Nanog。羊膜間充質(zhì)細(xì)胞的免疫表型則與骨髓來(lái)源間質(zhì)干細(xì)胞相似CD90、CD105、CD166、CD49e和人類白細(xì)胞抗原(HLA)ABC陽(yáng)性而CD31、CD34、CD45、CD49d、CD123和HLA-DR陰性,且其比骨髓來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞具有更強(qiáng)的擴(kuò)增能力[1]。羊膜上皮細(xì)胞和羊膜間充質(zhì)細(xì)胞都可以抑制人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖,而且呈劑量依賴關(guān)系[2]。羊膜是產(chǎn)后廢棄物,容易取材,羊膜細(xì)胞可以在體外大量分離培養(yǎng),它們的應(yīng)用不引起倫理學(xué)爭(zhēng)議。所有以上特點(diǎn)表明羊膜細(xì)胞在移植和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用中有望成為組織工程種子細(xì)胞的新的理想來(lái)源。 目的:本實(shí)驗(yàn)研究人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及其干細(xì)胞特性,并利用羊膜間充質(zhì)細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚修復(fù)裸鼠創(chuàng)面缺損,為羊膜間充質(zhì)細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)的潛在應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法:無(wú)菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的羊膜剪成碎片,經(jīng)胰酶膠原酶序貫消化,DMEM培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察其形態(tài),免疫熒光的方法對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行鑒定,流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)表面分子,定向誘導(dǎo)方法檢測(cè)細(xì)胞的多向分化潛能;利用羊膜間充質(zhì)細(xì)胞復(fù)合膠原構(gòu)建組織工程真皮組織,再在其上種植羊膜上皮細(xì)胞,形成雙層組織工程皮膚,含細(xì)胞的膠原基質(zhì)先在液下培養(yǎng)3天,然后移到氣液面培養(yǎng)2周,構(gòu)建好的組織工程皮膚最后用于修復(fù)裸鼠創(chuàng)面。 結(jié)果:來(lái)源于羊膜的上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞,細(xì)胞免疫熒光顯示SSEA-4、OCT-4陽(yáng)性,具有很強(qiáng)的增殖能力,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原如CD29、90、105不同程度的陽(yáng)性表達(dá)。兩種細(xì)胞都具有一定的多向分化能力,在特定條件下可分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。構(gòu)建的組織工程皮膚具有復(fù)層表皮,移植裸鼠創(chuàng)面后能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合。 結(jié)論:羊膜間充質(zhì)細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞能夠在體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增,并且具有干細(xì)胞特性。利用上述兩種細(xì)胞構(gòu)建的組織工程皮膚移植裸鼠創(chuàng)面后取得一定的修復(fù)效果,羊膜細(xì)胞構(gòu)建的組織工程皮膚在再生醫(yī)學(xué)和組織工程有很好的應(yīng)用前景。
【圖文】：

B分別示羊膜上皮細(xì)胞原代及第6代；C、D分別為羊膜間充質(zhì)細(xì)胞原代和第9代

為羊膜上皮細(xì)胞角蛋白染色陽(yáng)性；B為羊膜間充質(zhì)細(xì)胞波形絲蛋白染色陽(yáng)性
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉鵬;劉濤;李媛;鄧志宏;康曉軍;金巖;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合的研究[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年13期

2 于廣遠(yuǎn);高素珍;趙婷婷;高宏飛;練練;;人胎羊膜對(duì)糖尿病難愈性創(chuàng)面愈合影響的應(yīng)用研究[J];人民軍醫(yī);2008年02期

3 金巖,呂紅兵,劉源,趙宇,聶鑫,劉曉亮,張勇杰;人全層組織工程皮膚的研制[J];實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志;2002年02期

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本文編號(hào)：2561208