【摘要】：軟骨是一種半透明并且有彈性的組織,它的結(jié)構(gòu)和功能平衡至關(guān)重要。一旦這種平衡被打破,軟骨將會導(dǎo)致病變。關(guān)節(jié)軟骨由于缺乏血管供應(yīng)、神經(jīng)支配、淋巴回流,損傷后難以進行修復(fù)。隨著工程學(xué)、材料科學(xué)和細胞生物學(xué)的迅猛發(fā)展,用組織工程學(xué)技術(shù)體外制造具有生物學(xué)特性和功能的軟骨組織成為解決這一難題最有希望的方法。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)由于來源方便,擴增快,目前被認為是軟骨組織工程最佳的種子細胞。力學(xué)因素和生物化學(xué)因素在BMSCs向軟骨細胞分化的過程中起關(guān)鍵作用�；诖�,本課題分兩部分來研究滾壓載荷生物反應(yīng)器及不同狀態(tài)軟骨細胞對兔骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化的作用和不同狀態(tài)軟骨細胞在共培養(yǎng)系統(tǒng)下對骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞誘導(dǎo)分化作用。 1滾壓載荷生物反應(yīng)器促進兔骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化的研究 目的觀察滾壓載荷生物反應(yīng)器對BMSCs-瓊脂糖復(fù)合體中BMSCs向軟骨細胞誘導(dǎo)分化的作用。 方法分離新西蘭兔BMSCs,培養(yǎng)至第三代后與低熔點瓊脂糖復(fù)合成凝膠塊并在自制的模具中形成直徑為4mm高為4mm的圓柱形膠塊。將樣本分為TGF-β1+力學(xué)組、TGF-β1組、力學(xué)組和對照組進行不同的處理。在第7、14、21天時去各組標本進行實時定量PCR、GAG含量檢測以及組織學(xué)染色。 結(jié)果TGF-β1+力學(xué)組II型膠原基因表達在第7、14、21天三個時間點隨時間的推移逐漸增強,并在第21天時顯著增強。第7天TGF-β1+力學(xué)組、TGF-β1組、力學(xué)組II型膠原基因表達分別上調(diào)2.5±0.24(P0.05)、1.8±0.12和1.9±0.20倍,蛋白聚糖基因表達分別上調(diào)2.7±0.34(P0.05)、2.6±0.06和2.1±0.07倍。而對照組II型膠原基因表達下調(diào)0.6±0.08倍,蛋白聚糖基因表達下調(diào)0.8±0.10倍。第14天TGF-β1+力學(xué)組、TGF-β1組、力學(xué)組、對照組II型膠原基因表達分別上調(diào)5.7±0.61(P0.05)、3.4±0.54(P0.05)、3.2±0.36和1.2±0.22倍,蛋白聚糖基因表達分別上調(diào)8.6±1.61(P0.05)、7.7±1.42(P0.05)、6.7±0.93和1.2±0.04倍。第21天TGF-β1+力學(xué)組、TGF-β1組、力學(xué)組、對照組Ⅱ型膠原基因表達分別上調(diào)7.1±1.21(P0.05)、4.9±0.89(P0.05)、5.6±0.92(P0.05)和1.4±0.08倍,蛋白聚糖基因表達分別上調(diào)14.3±1.81(P0.05)、9.7±1.12(P0.05)、10.5±0.90和1.6±0.08倍。TGF-β1+力學(xué)組蛋白聚糖基因在第21天時也較對照組顯著增強并且高于其它兩組。對照組的Ⅱ型膠原和蛋白聚糖基因在三個時間點均未見明顯增強。TGF-β1+力學(xué)組、TGF-β1組、力學(xué)組、對照組的第7天的GAG含量分別為2.10±0.33、1.69±0.12、1.58±0.16、0.13±0.05μg/(mg濕重),第14天的GAG含量分別為3.56±0.32、2.33±0.25、2.64±0.085、0.20±0.04μg(/mg濕重),第21天的GAG含量分別為4.63±0.28、2.68±0.35、3.35±0.34、0.27±0.0118μg/(mg濕重)。TGF-β1+力學(xué)組GAG含量在三個時間點均明顯升高(P0.05)并且均高于其余三組。TGF-β1+力學(xué)組標本甲苯胺藍染色較其余各組明顯藍染,并有軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)。 結(jié)論滾壓載荷生物反應(yīng)器可以有效促進BMSCs-瓊脂糖復(fù)合體中BMSCs向軟骨細胞誘導(dǎo)分化。在結(jié)合TGF-β1后這種促進作用更加明顯。 2不同狀態(tài)軟骨細胞在共培養(yǎng)系統(tǒng)下對骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞誘導(dǎo)分化作用的研究 目的觀察不同代次正常軟骨細胞和關(guān)節(jié)炎軟骨細胞對瓊脂糖-BMSCs的向軟骨細胞分化的促進作用。 方法分離新西蘭兔BMSCs,正常軟骨細胞。制作兔關(guān)節(jié)炎模型,提取兔關(guān)節(jié)炎軟骨細胞。將BMSCs和低熔點瓊脂糖復(fù)合成凝膠塊,放在自制的六孔板網(wǎng)格架上,構(gòu)建兔軟骨細胞-BMCSs共培養(yǎng)系統(tǒng)。在3、7、14天取各組瓊脂糖-BMSCs凝膠塊進行實時定量PCR、GAG含量檢測。 結(jié)果兔關(guān)節(jié)炎模型制作成功,關(guān)節(jié)面色澤較灰暗,關(guān)節(jié)軟骨粗糙。Normal P0-BMSCs組第3、7、14天Ⅱ型膠原基因表達分別為同時間點對照組的5.11±0.3、7.2±0.39、11.2±0.58倍,Ⅰ型膠原分別為同時間點對照組的0.25±0.2、0.75±0.35、1.05±0.48倍,蛋白聚糖分別為同時間點對照組的2.1±0.22、3.8±0.41、22.5±0.39倍。Normal P3-BMSCs組第3、7、14天Ⅱ型膠原基因表達分別為同時間點對照組的0.71±0.3、1.5±0.57、1.8±0.38倍,Ⅰ型膠原分別為同時間點對照組的0.92±0.13、1.2±0.33、1.8±0.30倍,蛋白聚糖分別為同時間點對照組的0.7±0.22、1.0±0.28、1.58±0.40倍。OA P0-BMSCs組第3、7、14天Ⅱ型膠原基因表達分別為同時間點對照組的1.0±0.37、1.73±0.74、3.6±0.36倍,Ⅰ型膠原分別為同時間點對照組的0.98±0.22、0.65±0.14、1.21±0.22倍,蛋白聚糖分別為同時間點對照組的0.95±0.15、6.2±0.68、7.8±0.44倍。OA P3-BMSCs組第3、7、14天Ⅱ型膠原基因表達分別為同時間點對照組的1.1±0.35、0.67±0.39、1.51±0.22倍,Ⅰ型膠原分別為同時間點對照組的0.4±0.12、0.6±0.4、0.8±0.13倍,蛋白聚糖分別為同時間點對照組的1.28±0.28、0.95±0.39、1.12±0.41倍。Normal P0-BMSCs組的Ⅱ型膠原基因表達隨時間的增加明顯增強,Normal P3-BMSCs組Ⅰ、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖基因表達均未見明顯增強,OA P0-BMSCs組蛋白聚糖基因表達明顯增強,OA P3-BMSCs組Ⅰ型膠原基因表達水平在3個時間點均低于對照組。Normal P0-BMSCs、Normal P3-BMSCs、OA P0-BMSCs、OA P3-BMSCs組的GAG含量分別為5.7±0.49、2.3±0.41、2.5±0.31、1.8±0.59μg/(mg濕重)。OA P0-BMSCs組GAG含量與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),其余三組與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論兔正常P0軟骨細胞與兔關(guān)節(jié)炎P0軟骨細胞所分泌的形態(tài)發(fā)生素能夠有效促進BMSCs向軟骨細胞分化,而兔正常P3軟骨細胞的促分化作用微弱,兔關(guān)節(jié)炎P3軟骨細胞不能促進BMSCs向軟骨細胞分化。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻】

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1 張文元;楊亞冬;房國堅;陳勇;;誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細胞在關(guān)節(jié)軟骨缺損處成軟骨的效應(yīng)比較[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2007年02期

2 馮萬文;萊浙軍;李小民;常伶文;徐毓林;張麗;王曉紅;何向紅;夏亞一;黨躍修;吳萌;孫正義;靳白玉;李向東;;骨髓間充質(zhì)干細胞和軟骨細胞共培養(yǎng)種子細胞特征及體內(nèi)成軟骨活性[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2008年03期

3 倪云峰;李小飛;劉源;雷戰(zhàn)軍;盧強;;兔骨髓基質(zhì)干細胞與軟骨細胞混和培養(yǎng)體內(nèi)成軟骨(英文)[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2008年16期

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本文編號：2559432