【摘要】：視神經(jīng)損傷在臨床很常見(jiàn)，很多眼科疾病都會(huì)導(dǎo)致視神經(jīng)損傷，最終導(dǎo)致視力下降甚至失明，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)的逐漸死亡是視神經(jīng)損傷后視覺(jué)障礙不可逆轉(zhuǎn)的一個(gè)重要原因，目前臨床上尚無(wú)有效的治療方法。與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷類(lèi)似，視神經(jīng)受損傷后，即有部分細(xì)胞壞死，殘存的神經(jīng)細(xì)胞因缺血、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放、鈣超載、炎癥反應(yīng)等繼發(fā)性損傷而逐漸發(fā)生凋亡或死亡。經(jīng)典理論認(rèn)為成年哺乳動(dòng)物的視神經(jīng)損傷后是有再生反應(yīng)，但卻無(wú)再生能力。軸突損傷后，RGCs早期發(fā)生再生支芽，但不久就萎縮了，是“失敗”的再生。最近一二十年的基礎(chǔ)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明只要給予適當(dāng)?shù)膬?nèi)外微環(huán)境，視神經(jīng)軸突在損傷后是可以再生的，因此促進(jìn)受損的RGCs修復(fù)和再生是目前眼科研究的一個(gè)熱門(mén)話題。干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為細(xì)胞替代治療和促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)帶來(lái)了希望，但以往胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)元干細(xì)胞的應(yīng)用涉及倫理道德的限制而影響其的應(yīng)用。目前應(yīng)用最多的是間充質(zhì)干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有多項(xiàng)分化能力、造血支持、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注，并且在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為軟骨、脂肪、骨、肌肉、神經(jīng)等多種組織細(xì)胞，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)，是組織工程研究中較為理想的種子細(xì)胞。近幾年來(lái)間充質(zhì)干細(xì)胞一直被用于脊髓、腦缺血損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，研究顯示間充質(zhì)干細(xì)胞具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究擬建立SD大鼠視神經(jīng)急性鉗夾損傷模型，并用人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,hUCB-MSCs)移植到大鼠的眼玻璃體腔內(nèi)，探索hUCB-MSCs對(duì)大鼠急性視神經(jīng)損傷的抗凋亡與促進(jìn)神經(jīng)再生的作用，為將來(lái)彌補(bǔ)現(xiàn)有臨床治療手段的不足奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，這對(duì)神經(jīng)眼科學(xué)的發(fā)展和眼科臨床都有重要意義。 本課題研究包括兩部分，第一部分細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（hUCB-MSCs的分離、純化和鑒定）：采用密度梯度離心法和貼壁法從人臍帶血中分離提純間充質(zhì)干細(xì)胞并鑒定。第二部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（玻璃體腔內(nèi)移植hUCB-MSCs對(duì)大鼠急性視神經(jīng)損傷的抗凋亡與促進(jìn)神經(jīng)再生作用）：將動(dòng)物分為治療組、對(duì)照組和正常組，用熒光金（Fluorogold FG）逆行示蹤標(biāo)記SD大鼠視神經(jīng)急性損傷模型的RGCs并計(jì)數(shù)；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察視神經(jīng)急性損傷后和間充質(zhì)干細(xì)胞移植后視網(wǎng)膜的形態(tài)學(xué)變化；免疫熒光，Western Blotting和Real-Time PCR分析神經(jīng)軸突中生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43（growth associatedprotein43，GAP-43）蛋白的表達(dá)變化情況；免疫熒光和Real-Time PCR檢測(cè)ATP配體門(mén)控嘌呤受體P2X7蛋白的表達(dá)情況；免疫熒光檢測(cè)促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2、半胱氨酸蛋白酶Caspase-3蛋白的表達(dá)情況；Tunel原位檢測(cè)細(xì)胞的凋亡水平等手段比較各組的差別。 本研究的主要結(jié)果如下： 1．hUCB-MSCs體外分離純化培養(yǎng)體外分離純化的hUCB-MSCs與文獻(xiàn)報(bào)道一致：光鏡下呈雙極狀態(tài)，兩個(gè)突起的長(zhǎng)梭形或扁平形的成纖維樣細(xì)胞。流式細(xì)胞儀鑒定為：CD13、CD29、CD44、CD105、CD90呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性，而CD34、CD45，HLA-DR則表現(xiàn)為弱陽(yáng)性，證實(shí)為間充質(zhì)干細(xì)胞。 2. SD大鼠大腦立體定位熒光金逆行示蹤標(biāo)記RGCs并計(jì)數(shù)無(wú)論對(duì)照組還是治療組RGCs數(shù)目都是隨時(shí)間逐漸遞減的，但同一時(shí)間點(diǎn)下治療組的RGCs數(shù)目都要比對(duì)照組多（P0.05）。 3. HE染色無(wú)論對(duì)照組還是治療組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)RGCs數(shù)目逐漸減少，視網(wǎng)膜各層排列逐漸紊亂，并出現(xiàn)畸形核，有的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層出現(xiàn)長(zhǎng)片段的細(xì)胞缺失，但治療組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)下RGCs的數(shù)目、視網(wǎng)膜各層的紊亂程度都要比對(duì)照組佳。 4. GAP-43蛋白的表達(dá)變化情況免疫熒光顯示正常視網(wǎng)膜內(nèi)各層GAP-43表達(dá)量極少，僅在內(nèi)叢狀層見(jiàn)很少量的表達(dá)，視神經(jīng)損傷后于對(duì)照組見(jiàn)表達(dá)量稍增加，第7d和14d較明顯，之后急劇下降；hUCB-MSCs移植治療組于第7d和14d時(shí)GAP-43表達(dá)明顯增加并達(dá)峰值之后開(kāi)始下降。Western檢測(cè)結(jié)果顯示無(wú)論是對(duì)照組還是治療組GAP-43蛋白表達(dá)第3d時(shí)和正常組的差異不大，第7d、14d蛋白表達(dá)明顯增高，但第14d蛋白水平比7d組的蛋白表達(dá)略少，開(kāi)始下降。但治療組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)下目的蛋白的表達(dá)水平的相對(duì)灰度值都要比對(duì)照組的高，這和免疫熒光檢測(cè)結(jié)果相一致；Real-Time PCR顯示目的基因GAP-43的mRNA水平治療組于傷后第3d達(dá)到峰值，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)急劇減少，第21d基因水平極低，與對(duì)照組和正常組差異明顯（P0.01）；對(duì)照組于傷后第3d和正常組差異不明顯（P㧐0.05），之后隨時(shí)間延長(zhǎng)急劇下降，第7d、14d與治療組和正常組差異明顯（P0.01），第21d和治療組無(wú)差異（P㧐0.05）和正常組差異明顯（P0.01）。 5.嘌呤能受體P2X7的表達(dá)變化情況免疫熒光顯示P2X7的表達(dá)量于視神經(jīng)損傷后隨時(shí)間延長(zhǎng)是逐漸增多的，但對(duì)照組的表達(dá)量明顯比治療組要高。P2X7的mRNA水平變化情況：對(duì)照組的mRNA水平于損傷后第3d開(kāi)始增高，但和正常組、治療組差異不明顯（P㧐0.05），第7d開(kāi)始和正常組有差異（P0.05），和治療組差異不明顯（P㧐0.05），之后急劇上升和治療組、正常組差異明顯（P0.01）；治療組于損傷后第3d、7d、14d和正常組差異不明顯（P㧐0.05）之后開(kāi)始上升，第21d和正常組有差異（P0.05）。 6.促凋亡基因Bax、抑凋亡基因Bcl-2與Caspase-3的表達(dá)情況免疫熒光顯示Bax的表達(dá)情況于視神經(jīng)損傷后對(duì)照組和治療組都隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多，但對(duì)照組的表達(dá)量比治療組高；Bcl-2在對(duì)照組中第3d表達(dá)量很高，，隨后逐漸降低，治療組于第3、7、14d表達(dá)都很高，第21d稍降低；Caspase-3于視神經(jīng)損傷后逐漸增多，但對(duì)照組的表達(dá)量要比治療組高； 7．Tunel染色無(wú)論對(duì)照組還是治療組隨時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞都逐漸增多，但治療組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)下凋亡細(xì)胞都要比對(duì)照組少。 結(jié)論：hUCB-MSCs在大鼠視神經(jīng)急性損傷中可能具有抗凋亡和促進(jìn)再生的作用。
【圖文】：

圖1：熒光金逆行標(biāo)記五、視神經(jīng)急性損傷模型的建立10％水合氯醛（0.3ml/mg）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于鼠臺(tái)上，在解剖顯微下垂直于瞼緣方向剪開(kāi)上瞼中部，直到眶上緣，沿 9 點(diǎn)-3 點(diǎn)鐘位置剪開(kāi)球結(jié)膜和部穹隆結(jié)膜，暴露并剪斷上直肌，向下方牽拉眼球，分離視神經(jīng)周?chē)浗M織并充分暴視神經(jīng)。Yasargil 腦動(dòng)脈瘤夾以 30g 的夾力于球后 2mm 處夾持視神經(jīng)，注意 Yasar腦動(dòng)脈瘤夾與視神經(jīng)的長(zhǎng)軸垂直，致傷時(shí)間為 30 秒，松開(kāi) Yasargil 腦動(dòng)脈瘤夾后合球結(jié)膜，結(jié)膜囊內(nèi)涂迪可羅眼膏。納入標(biāo)準(zhǔn)：夾持后立即觀察，如果大鼠傷眼瞳孔散大，直接對(duì)光反射消失，間對(duì)光反射存在，視網(wǎng)膜血管無(wú)出血或梗塞，傷后 5 分鐘內(nèi)血流完全恢復(fù)可納入實(shí)驗(yàn)

圖1：熒光金逆行標(biāo)記性損傷模型的建立ml/mg）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于上瞼中部，直到眶上緣，沿 9 點(diǎn)-3 點(diǎn)鐘上直肌，向下方牽拉眼球，分離視神經(jīng)瘤夾以 30g 的夾力于球后 2mm 處夾長(zhǎng)軸垂直，致傷時(shí)間為 30 秒，松開(kāi) 迪可羅眼膏。立即觀察，如果大鼠傷眼瞳孔散大，直血管無(wú)出血或梗塞，傷后 5 分鐘內(nèi)血
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2558793