【摘要】：目的:采用小鼠巨細胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)感染同種異型皮膚移植小鼠,建立MCMV感染急性結腸炎癥模型,從而為研究HCMV結腸炎致病機制和臨床診斷和治療提供可靠的動物模型。 方法:第一部分:臨床資料: 2011年1月～2011年4月期間在從安徽中醫(yī)學院內鏡中心收集36份接受腸鏡檢查后確診為急性結腸炎的標本,男23例,女13例,年齡分布為45～82歲,鉗取的標本為損傷部位的邊緣部位,按實驗設計分別做HCMV感染的實驗室檢測:(1)HCMV病毒分離,將標本研磨離心后取上清接種至人胚肺成纖維細胞(HELF)上,逐日觀察細胞病變效應(Cytopathic effect,CPE),并對病變的細胞進行pp65抗原間接免疫熒光( IFA,indirect immunofluorescence)染色;(2)采用PCR檢測標本中HCMV IE基因,記錄分析結果,初步確定急性結腸炎患者中HCMV的感染率及感染狀態(tài)。 第二部分:動物模型的建立:采用鼻腔接種的方式感染同種異型皮膚移植的小鼠。①供體:C57BL/6雌鼠,18只;受體:BALB/c雌鼠,72只,鼠齡4～6周,體重14～20g/只;將C57BL/6小鼠的背部大小約(1.0cm×1.0cm)皮片移植到BALB/c小鼠背部的移植床上,術后給BALB/c小鼠腹腔注射環(huán)孢素連續(xù)2周(15mg/kg.d)。②將移植后小鼠隨機分為3組,其中感染組分為兩組,按接種病毒接種劑量分為104PFU組和105PFU組,同時設立一組陰性對照組,即鼻腔接種細胞懸液,每組24只。每日觀察動物體重等一般情況及排便情況;分別于病毒接種后第5、9、14和第21d取得小鼠結腸組織,通過病毒分離、HE染色、透射電鏡、MCMV M55基因RT-PCR、原位雜交以及pp65抗原免疫組化的方法,觀察檢測小鼠結腸組織中MCMV與其組織病理變化之間的關聯(lián)性。 結果:(1)通過對所收集的患者結腸標本進行HCMV IE基因PCR、病毒分離和pp65抗原間接免疫熒光檢測,發(fā)現(xiàn)幾乎所有患者的結腸組織中均有HCMV感染,陽性率可高達91.67%;標本在盲傳3代后,細胞出現(xiàn)CPE,且HCMV IE基因PCR有陽性條帶出現(xiàn),通過統(tǒng)計分析:收集標本分離陽性率為36.1%。對病毒分離陽性的樣本進行pp65抗原間接免疫熒光檢測,發(fā)現(xiàn)有蘋果綠色的陽性信號出現(xiàn),說明HCMV處于復制增殖的狀態(tài)。 (2)對三組小鼠進行生存狀況觀察發(fā)現(xiàn),感染過程中105PFU組小鼠出現(xiàn)厭食、嗜睡、活動能力明顯下降,并且發(fā)現(xiàn)該組小鼠的體重明顯減輕(p0.01)。在對三組小鼠結腸組織病理觀察發(fā)現(xiàn),感染第14d,感染組小鼠的近端結腸組織粘膜層變薄,同時其結構也被破壞;感染組小鼠的遠端結腸組織也均出現(xiàn)淋巴樣濾泡和粘膜層結構異常,其中105PFU組小鼠的結腸粘膜層結構紊亂,并出現(xiàn)大面積炎性細胞浸潤;腸道組織通過病毒分離后,發(fā)現(xiàn)MEF上出現(xiàn)典型的CPE;透射電鏡觀察可見皰疹樣病毒顆粒;原位雜交結果顯示結腸組織中MCMV IE1基因陽性,MCMV M55基因RT-PCR檢測結果為陽性; pp65抗原免疫組化檢驗結果為MCMV pp65蛋白陽性。而陰性對照組上述檢測指標均為陰性。 結論:(1)HCMV感染普遍存在于急性結腸炎患者腸道組織中,且陽性率為91.67%。但該病毒的活動性感染率也高達36.1%。這些證據(jù)初步表明:HCMV活動性感染可能與該病的發(fā)生發(fā)展和結局密切相關,這為急性結腸炎的臨床診斷治療提供了新思路。尤其在激素治療無效的急性結腸炎患者中,應及時采用抗病毒治療。(2)通過對同種異型皮膚移植后小鼠鼻腔接種MCMV,首次成功建立MCMV感染同種異型皮膚移植小鼠急性結腸炎模型,小鼠結腸發(fā)生了類似人類結腸炎癥的病理變化。該模型為進一步研究HCMV結腸炎的發(fā)病機理及藥物干預建立一個極為重要的平臺,同時也為臨床上研究進一步治療人類病毒相關性結腸炎癥提供了重要動物模型。
【圖文】：

圖 1 患者結腸組織標本 HCMV IE 基因 PCR 檢測Fig1 Detection of HCMV IE gene PCR in colitis patient泳道 M：DL2000 DNA Marker Lane M: DL2000 DNAMarker泳道 1：陽性對照 Lane 1: positive control泳道 2：陰性對照 Lane 2: negative control泳道 3-16：患者結腸標本 Lane 3-16: colon samples in patients分離對所有的標本進行病毒分離，在盲傳 3 代后，在細胞培養(yǎng)因此說明病毒是處于活動性感染狀態(tài)的；進行 HCMV IE 標本中出現(xiàn)條帶的位置和陽性對照是一致的（見圖 3）。p示，在細胞核內和胞漿中均發(fā)現(xiàn)有蘋果綠色的陽性信號出

腸標本中 HCMV 在 HELF 上的 CPE（未染色，，×LF infection with HCMV of colon samples（uns: 正常 HELF 細胞 B: HCMV 感染后的 HELF A: normal HELF B: HELF infection with HB
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R574.62;R-332

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本文編號：2549242