【摘要】：目的:采用小鼠巨細(xì)胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)感染同種異型皮膚移植小鼠,建立MCMV感染急性結(jié)腸炎癥模型,從而為研究HCMV結(jié)腸炎致病機(jī)制和臨床診斷和治療提供可靠的動(dòng)物模型。 方法:第一部分:臨床資料: 2011年1月～2011年4月期間在從安徽中醫(yī)學(xué)院內(nèi)鏡中心收集36份接受腸鏡檢查后確診為急性結(jié)腸炎的標(biāo)本,男23例,女13例,年齡分布為45～82歲,鉗取的標(biāo)本為損傷部位的邊緣部位,按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別做HCMV感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè):(1)HCMV病毒分離,將標(biāo)本研磨離心后取上清接種至人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)上,逐日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE),并對(duì)病變的細(xì)胞進(jìn)行pp65抗原間接免疫熒光( IFA,indirect immunofluorescence)染色;(2)采用PCR檢測(cè)標(biāo)本中HCMV IE基因,記錄分析結(jié)果,初步確定急性結(jié)腸炎患者中HCMV的感染率及感染狀態(tài)。 第二部分:動(dòng)物模型的建立:采用鼻腔接種的方式感染同種異型皮膚移植的小鼠。①供體:C57BL/6雌鼠,18只;受體:BALB/c雌鼠,72只,鼠齡4～6周,體重14～20g/只;將C57BL/6小鼠的背部大小約(1.0cm×1.0cm)皮片移植到BALB/c小鼠背部的移植床上,術(shù)后給BALB/c小鼠腹腔注射環(huán)孢素連續(xù)2周(15mg/kg.d)。②將移植后小鼠隨機(jī)分為3組,其中感染組分為兩組,按接種病毒接種劑量分為104PFU組和105PFU組,同時(shí)設(shè)立一組陰性對(duì)照組,即鼻腔接種細(xì)胞懸液,每組24只。每日觀察動(dòng)物體重等一般情況及排便情況;分別于病毒接種后第5、9、14和第21d取得小鼠結(jié)腸組織,通過(guò)病毒分離、HE染色、透射電鏡、MCMV M55基因RT-PCR、原位雜交以及pp65抗原免疫組化的方法,觀察檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中MCMV與其組織病理變化之間的關(guān)聯(lián)性。 結(jié)果:(1)通過(guò)對(duì)所收集的患者結(jié)腸標(biāo)本進(jìn)行HCMV IE基因PCR、病毒分離和pp65抗原間接免疫熒光檢測(cè),發(fā)現(xiàn)幾乎所有患者的結(jié)腸組織中均有HCMV感染,陽(yáng)性率可高達(dá)91.67%;標(biāo)本在盲傳3代后,細(xì)胞出現(xiàn)CPE,且HCMV IE基因PCR有陽(yáng)性條帶出現(xiàn),通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析:收集標(biāo)本分離陽(yáng)性率為36.1%。對(duì)病毒分離陽(yáng)性的樣本進(jìn)行pp65抗原間接免疫熒光檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有蘋果綠色的陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn),說(shuō)明HCMV處于復(fù)制增殖的狀態(tài)。 (2)對(duì)三組小鼠進(jìn)行生存狀況觀察發(fā)現(xiàn),感染過(guò)程中105PFU組小鼠出現(xiàn)厭食、嗜睡、活動(dòng)能力明顯下降,并且發(fā)現(xiàn)該組小鼠的體重明顯減輕(p0.01)。在對(duì)三組小鼠結(jié)腸組織病理觀察發(fā)現(xiàn),感染第14d,感染組小鼠的近端結(jié)腸組織粘膜層變薄,同時(shí)其結(jié)構(gòu)也被破壞;感染組小鼠的遠(yuǎn)端結(jié)腸組織也均出現(xiàn)淋巴樣濾泡和粘膜層結(jié)構(gòu)異常,其中105PFU組小鼠的結(jié)腸粘膜層結(jié)構(gòu)紊亂,并出現(xiàn)大面積炎性細(xì)胞浸潤(rùn);腸道組織通過(guò)病毒分離后,發(fā)現(xiàn)MEF上出現(xiàn)典型的CPE;透射電鏡觀察可見(jiàn)皰疹樣病毒顆粒;原位雜交結(jié)果顯示結(jié)腸組織中MCMV IE1基因陽(yáng)性,MCMV M55基因RT-PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性; pp65抗原免疫組化檢驗(yàn)結(jié)果為MCMV pp65蛋白陽(yáng)性。而陰性對(duì)照組上述檢測(cè)指標(biāo)均為陰性。 結(jié)論:(1)HCMV感染普遍存在于急性結(jié)腸炎患者腸道組織中,且陽(yáng)性率為91.67%。但該病毒的活動(dòng)性感染率也高達(dá)36.1%。這些證據(jù)初步表明:HCMV活動(dòng)性感染可能與該病的發(fā)生發(fā)展和結(jié)局密切相關(guān),這為急性結(jié)腸炎的臨床診斷治療提供了新思路。尤其在激素治療無(wú)效的急性結(jié)腸炎患者中,應(yīng)及時(shí)采用抗病毒治療。(2)通過(guò)對(duì)同種異型皮膚移植后小鼠鼻腔接種MCMV,首次成功建立MCMV感染同種異型皮膚移植小鼠急性結(jié)腸炎模型,小鼠結(jié)腸發(fā)生了類似人類結(jié)腸炎癥的病理變化。該模型為進(jìn)一步研究HCMV結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)理及藥物干預(yù)建立一個(gè)極為重要的平臺(tái),同時(shí)也為臨床上研究進(jìn)一步治療人類病毒相關(guān)性結(jié)腸炎癥提供了重要?jiǎng)游锬Ｐ汀?br>【圖文】：

圖 1 患者結(jié)腸組織標(biāo)本 HCMV IE 基因 PCR 檢測(cè)Fig1 Detection of HCMV IE gene PCR in colitis patient泳道 M：DL2000 DNA Marker Lane M: DL2000 DNAMarker泳道 1：陽(yáng)性對(duì)照 Lane 1: positive control泳道 2：陰性對(duì)照 Lane 2: negative control泳道 3-16：患者結(jié)腸標(biāo)本 Lane 3-16: colon samples in patients分離對(duì)所有的標(biāo)本進(jìn)行病毒分離，在盲傳 3 代后，在細(xì)胞培養(yǎng)因此說(shuō)明病毒是處于活動(dòng)性感染狀態(tài)的；進(jìn)行 HCMV IE 標(biāo)本中出現(xiàn)條帶的位置和陽(yáng)性對(duì)照是一致的（見(jiàn)圖 3）。p示，在細(xì)胞核內(nèi)和胞漿中均發(fā)現(xiàn)有蘋果綠色的陽(yáng)性信號(hào)出

腸標(biāo)本中 HCMV 在 HELF 上的 CPE（未染色，，×LF infection with HCMV of colon samples（uns: 正常 HELF 細(xì)胞 B: HCMV 感染后的 HELF A: normal HELF B: HELF infection with HB
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R574.62;R-332

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本文編號(hào)：2549242