【摘要】：本研究旨在分離鑒定蒙古羊羊水源干細胞(Amniotic fluid-derived stem cells,AFSC),并對其生物學特征及分化潛能進行探究,為以AFSC為種質資源生產(chǎn)克隆羊、轉基因羊奠定理論基礎。 經(jīng)過培養(yǎng)不同孕期蒙古羊AFSC,發(fā)現(xiàn)羊水采集時間對AFSC的貼壁率及細胞活性影響較大,孕中期AFSC貼壁率比孕早期的高,細胞活性比孕晚期的強,采集AFSC的最佳時期為孕中期。 15% FBS可維持孕中期蒙古羊AFSC增殖50代以上,其形態(tài)及生物特性保持不變,細胞生長速度及增殖能力無明顯差異。 細胞培養(yǎng)初期,通過機械分離法,并有效配合胰蛋白酶消化時間,去除成纖維狀細胞中混雜的上皮樣細胞,可在5代之內(nèi)純化。純化的AFSC形態(tài)上為梭型,細胞匯合有方向性,集落呈典型渦旋狀排列。 利用RT-PCR檢測不同代數(shù)AFSC,結果表明蒙古羊AFSC表達干細胞標志基因Oct-4, Nanog, SH2, SSEA-1, CD117和HLA-A等。 蒙古羊AFSC懸浮培養(yǎng)時,可形成典型的類胚體,并表達三胚層標志基因fgf5 (外胚層)、α-fetoprotein (內(nèi)胚層)和ζ-globin (中胚層)。 利用地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉對蒙古羊AFSC誘導后細胞生長相對變緩,邊緣變模糊,局部出現(xiàn)復層生長,并形成顆粒狀結節(jié)。誘導三周后細胞堿性磷酸酶活性顯著增加,茜素紅染色呈紅色,表明誘導成功。 研究結果表明本試驗從蒙古羊羊水中分離得到的細胞具有一定的干細胞特性,在體外有很強的增殖和分化能力,并在特定條件下可形成成骨細胞。
【圖文】：

圖 1 AFSC 的體外分離培養(yǎng)[39]Fig.1 The isolation and culture of AFSC in vitro研究者從懷有男嬰的羊水中獲取的 AFSC 分析發(fā)現(xiàn)染色體為 XY 型，這C 來源于胎兒而非母體[24,40]。2003 年有人提出孕期羊水中含 Oct-4 陽性細能是多能干細胞，以后的幾年里 AFSC 的研究熱度一直沒減，但至今還沒完善的 AFSC 培養(yǎng)體系。在 ESCs 的培養(yǎng)中經(jīng)常采用小鼠成纖維細胞為飼

3 結果3.1 AFSC 細胞形態(tài)原代AFSC貼壁生長較慢，初次傳代時間在6～7 d。傳代后生長速度加快，傳代比例為1：3時需每3～4 d傳一次，比例為1：2時需每2 d傳一次。初次培養(yǎng)時，可觀察到梭形的成纖維細胞集落中有多角形的上皮樣細胞集落混雜（圖2.a）。貼壁細胞濃度不高時集落之間不接觸，可通過細胞刮反復將上皮樣細胞集落刮除，從而初步純化成纖維狀AFSC。傳至5代左右后，上皮樣細胞逐漸減少甚至消失，，以成纖維狀細胞為主，當細胞匯合時排列有方向性，集落呈渦旋狀，輻射狀排列（圖2.b）。
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

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