發(fā)布時(shí)間：2019-09-29 06:25

【摘要】：本研究旨在分離鑒定蒙古羊羊水源干細(xì)胞(Amniotic fluid-derived stem cells,AFSC),并對(duì)其生物學(xué)特征及分化潛能進(jìn)行探究,為以AFSC為種質(zhì)資源生產(chǎn)克隆羊、轉(zhuǎn)基因羊奠定理論基礎(chǔ)。 經(jīng)過(guò)培養(yǎng)不同孕期蒙古羊AFSC,發(fā)現(xiàn)羊水采集時(shí)間對(duì)AFSC的貼壁率及細(xì)胞活性影響較大,孕中期AFSC貼壁率比孕早期的高,細(xì)胞活性比孕晚期的強(qiáng),采集AFSC的最佳時(shí)期為孕中期。 15% FBS可維持孕中期蒙古羊AFSC增殖50代以上,其形態(tài)及生物特性保持不變,細(xì)胞生長(zhǎng)速度及增殖能力無(wú)明顯差異。 細(xì)胞培養(yǎng)初期,通過(guò)機(jī)械分離法,并有效配合胰蛋白酶消化時(shí)間,去除成纖維狀細(xì)胞中混雜的上皮樣細(xì)胞,可在5代之內(nèi)純化。純化的AFSC形態(tài)上為梭型,細(xì)胞匯合有方向性,集落呈典型渦旋狀排列。 利用RT-PCR檢測(cè)不同代數(shù)AFSC,結(jié)果表明蒙古羊AFSC表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志基因Oct-4, Nanog, SH2, SSEA-1, CD117和HLA-A等。 蒙古羊AFSC懸浮培養(yǎng)時(shí),可形成典型的類胚體,并表達(dá)三胚層標(biāo)志基因fgf5 (外胚層)、α-fetoprotein (內(nèi)胚層)和ζ-globin (中胚層)。 利用地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉對(duì)蒙古羊AFSC誘導(dǎo)后細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)變緩,邊緣變模糊,局部出現(xiàn)復(fù)層生長(zhǎng),并形成顆粒狀結(jié)節(jié)。誘導(dǎo)三周后細(xì)胞堿性磷酸酶活性顯著增加,茜素紅染色呈紅色,表明誘導(dǎo)成功。 研究結(jié)果表明本試驗(yàn)從蒙古羊羊水中分離得到的細(xì)胞具有一定的干細(xì)胞特性,在體外有很強(qiáng)的增殖和分化能力,并在特定條件下可形成成骨細(xì)胞。
【圖文】：

圖 1 AFSC 的體外分離培養(yǎng)[39]Fig.1 The isolation and culture of AFSC in vitro研究者從懷有男嬰的羊水中獲取的 AFSC 分析發(fā)現(xiàn)染色體為 XY 型，這C 來(lái)源于胎兒而非母體[24,40]。2003 年有人提出孕期羊水中含 Oct-4 陽(yáng)性細(xì)能是多能干細(xì)胞，以后的幾年里 AFSC 的研究熱度一直沒(méi)減，但至今還沒(méi)完善的 AFSC 培養(yǎng)體系。在 ESCs 的培養(yǎng)中經(jīng)常采用小鼠成纖維細(xì)胞為飼

3 結(jié)果3.1 AFSC 細(xì)胞形態(tài)原代AFSC貼壁生長(zhǎng)較慢，初次傳代時(shí)間在6～7 d。傳代后生長(zhǎng)速度加快，傳代比例為1：3時(shí)需每3～4 d傳一次，比例為1：2時(shí)需每2 d傳一次。初次培養(yǎng)時(shí)，可觀察到梭形的成纖維細(xì)胞集落中有多角形的上皮樣細(xì)胞集落混雜（圖2.a）。貼壁細(xì)胞濃度不高時(shí)集落之間不接觸，可通過(guò)細(xì)胞刮反復(fù)將上皮樣細(xì)胞集落刮除，從而初步純化成纖維狀A(yù)FSC。傳至5代左右后，上皮樣細(xì)胞逐漸減少甚至消失，，以成纖維狀細(xì)胞為主，當(dāng)細(xì)胞匯合時(shí)排列有方向性，集落呈渦旋狀，輻射狀排列（圖2.b）。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2543742