【摘要】：結(jié)核病是一種重大傳染性疾病，因?yàn)槠渲虏【Y(jié)核桿菌抵抗力、耐藥性、休眠特性等，治療肺結(jié)核一直是一個難題。唯一的肺結(jié)核疫苗卡介苗（BCG）是結(jié)核桿菌的減毒株，現(xiàn)在廣泛用于新生兒的單針免疫，許多研究顯示BCG對新生兒保護(hù)力較好，但對于成人的保護(hù)力從0%-80%不等。目前的新型基因工程疫苗，一般以BCG或rBCG進(jìn)行初次免疫，以減毒活疫苗，病毒載體疫苗（痘病毒，腺病毒），蛋白疫苗，核酸疫苗等進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在誘導(dǎo)持續(xù)的強(qiáng)烈CD4+和CD8+細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，以及Th1細(xì)胞因子（尤其是IFN-γ）分泌方面，無論對于全菌體疫苗還是亞單位的疫苗，都是一個重大的挑戰(zhàn)。結(jié)核桿菌有很多分泌性抗原：如Ag85B是一種分泌蛋白，屬于分枝菌酸轉(zhuǎn)移酶家族，其家族有三個組分，Ag85A，85B，85C，其中85A、85B已經(jīng)經(jīng)研究顯示出較高的免疫原性，而且在小鼠模型和豚鼠模型中具有較好的免疫保護(hù)力。ESAT6是RD區(qū)的基因，在BCG中缺失，但是在結(jié)核桿菌中存在。很多研究都致力于BCG中缺失的片段，，以期恢復(fù)其完整的免疫原性�，F(xiàn)在廣泛研究的6Kd早期分泌蛋白ESAT6可以引起激活T-cell干擾素γ分泌的抗原。Ag85B、ESAT6都是抵抗結(jié)核桿菌侵染的主要保護(hù)性抗原，兩種基因的融合，可擴(kuò)大免疫原性范圍，并已經(jīng)證實(shí)在動物模型中有較強(qiáng)的免疫原性及保護(hù)力。 本研究意義在于：第一，將本室研究的rAD，rMVA，rBCG按疫苗生產(chǎn)中傳代穩(wěn)定性的要求完成檢測，以保證一定代次內(nèi)疫苗的質(zhì)量要求。第二，引入人組織型纖溶酶原激活因子前導(dǎo)信號肽tPA融合在目的片段N端，引導(dǎo)外源蛋白出膜，同時提高外源蛋白表達(dá)量。第三，利用MVA-tPA-Ag85B-ESAT6免疫小鼠，以期提高抗原免疫原性，甚至保護(hù)力的增加，為病毒載體疫苗研究做一定鋪墊。 本研究內(nèi)容如下： 第一部分：實(shí)驗(yàn)研究將本室制備的MVA-Ag85B-ESAT6在BHK-TK-細(xì)胞系中傳代20次，AD-Ag85B-ESAT6在293細(xì)胞系中傳代20次，以及BCG-Ag85B在蘇通培養(yǎng)基中傳代20次，Westernblot檢測蛋白表達(dá)驗(yàn)證蛋白表達(dá)水平的穩(wěn)定，提取基因組PCR擴(kuò)增驗(yàn)證基因沒有丟失，沒有野生型污染，并測序驗(yàn)證基因沒有發(fā)生回復(fù)突變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明三種結(jié)核疫苗穩(wěn)定性較好，可達(dá)到生物制品質(zhì)量要求，在20代次內(nèi)可以應(yīng)用。 第二部分：設(shè)計(jì)人源密碼子偏好序列（定義為真核序列），以及天然序列（定義為原核序列）Ag85B-ESAT6，融合tPA信號肽后并構(gòu)建重組pcDNA3.1(-)轉(zhuǎn)染293T、BHK-TK-細(xì)胞檢測蛋白表達(dá)結(jié)果，證明在pcDNA3.1(-)載體上，由tPA引導(dǎo)的序列可成功于BHK-TK-細(xì)胞系和293T細(xì)胞系的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外提高外源蛋白表達(dá)量2-10倍，進(jìn)而證明tPA的引導(dǎo)蛋白出膜作用和提高蛋白表達(dá)量的作用。 第三部分：選擇降解最少、糖基化最少、表達(dá)量較高的tPA-Ag85B-ESAT6(原核)序列構(gòu)建的重組pSC11M1質(zhì)粒與空MVA重組進(jìn)行病毒篩選，篩選出陽性克隆MVA-tPA-Ag85B-ESAT6并大量擴(kuò)增后密度梯度離心純化，檢測滴度，與PBS、MVA-blank、MVA-Ag85B-ESAT6同時皮下免疫BALB/c小鼠，檢測細(xì)胞免疫和體液免疫效果。結(jié)果顯示，MVA-tPA-Ag85B-ESAT6免疫后在細(xì)胞免疫方面，脾細(xì)胞被MHCI類限制性表位肽刺激后分泌IFN-γ的能力有很大提高，以及針對MVA載體本身的非特異性應(yīng)答提高，細(xì)胞免疫呈Th1傾向且免疫1week時有CD8激活亞群比例的提高，體液免疫中IgG抗體水平只有小幅度提高。經(jīng)過蛋白抗原刺激的脾細(xì)胞并沒有在細(xì)胞因子IL-2和GM-CSF分泌上體現(xiàn)明顯的提高趨勢，僅與無tPA的MVA水平相當(dāng)。這些結(jié)果證實(shí)了MVA-tPA-Ag85B-ESAT6在小鼠中免疫一周時達(dá)到一個免疫應(yīng)答的峰值，一定程度上提高了免疫原性。 本研究為tPA修飾的MVA病毒載體疫苗研究做了一定的鋪墊，但是tPA具體作用機(jī)制、tPA修飾的病毒載體疫苗保護(hù)力如何以及更體系化的免疫實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392.11

【參考文獻(xiàn)】

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1 王長永;分泌表達(dá)結(jié)核分枝桿菌Ag85B蛋白的重組卡介苗的構(gòu)建和免疫學(xué)特性的初步研究[D];吉林大學(xué);2008年

本文編號：2542161