發(fā)布時(shí)間：2019-09-20 15:24

【摘要】：吞噬是鏈接固有免疫和適應(yīng)性免疫的重要免疫機(jī)制，其特征包括吞噬物直徑大于0.5μm、肌動(dòng)蛋白的聚合和重構(gòu)、以及吞噬溶酶體（phagolysosomes）的形成等。吞噬在固有免疫中直接參與對(duì)病原的殺傷，而且吞噬機(jī)制中對(duì)抗原成分的分解是進(jìn)一步的抗原處理和呈遞的基礎(chǔ)，因而也參與適應(yīng)性免疫。經(jīng)典免疫學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為，吞噬一般由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等專職吞噬細(xì)胞或上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等非專職吞噬細(xì)胞執(zhí)行；而B淋巴細(xì)胞作為專職分泌抗體的適應(yīng)性免疫細(xì)胞，不具有吞噬能力。近年來(lái)，在早期脊椎動(dòng)物如硬骨魚、兩棲動(dòng)物及爬行動(dòng)物體內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了B細(xì)胞具有專職吞噬殺菌能力。而晚期脊椎動(dòng)物如哺乳動(dòng)物B細(xì)胞是否具有吞噬能力尚不明確。 諸多線索提示B-1細(xì)胞很可能具有專職的吞噬能力。B-1細(xì)胞是一群不同于傳統(tǒng)B-2細(xì)胞的B淋巴細(xì)胞亞群；在解剖上主要定位于腹膜腔、胸膜腔和腦脊髓膜腔等漿膜腔，表達(dá)既往認(rèn)為只表達(dá)于專職吞噬細(xì)胞的CD11b分子，體外培養(yǎng)時(shí)可貼壁生長(zhǎng)，外觀上也更接近巨噬細(xì)胞，發(fā)育上與巨噬細(xì)胞等專職吞噬細(xì)胞關(guān)系密切，在演化上也對(duì)應(yīng)于硬骨魚等早期脊椎動(dòng)物的B細(xì)胞；因而很有可能保留有吞噬功能。為進(jìn)一步解釋B細(xì)胞的演化路徑及其在固有免疫及適應(yīng)性免疫中的作用，本課題對(duì)小鼠B細(xì)胞的吞噬功能進(jìn)行了深入研究。 主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果： 1） B細(xì)胞吞噬現(xiàn)象形態(tài)學(xué)分析：利用C57/BL6小鼠為研究對(duì)象，腹腔注射FITC標(biāo)記的60Co滅活金黃葡萄球菌、大腸桿菌及熒光微球，30分鐘后灌洗腹腔（在體吞噬實(shí)驗(yàn)），取腹腔細(xì)胞磁珠分選B細(xì)胞行透射電鏡觀察；以及熒光標(biāo)記CD19等以激光共聚焦顯微鏡觀察以及流式分析。結(jié)果顯示腹腔及脾臟B細(xì)胞吞噬了金葡菌、大腸桿菌及熒光微球。 2）肌動(dòng)蛋白在B細(xì)胞吞噬中的作用分析：取野生型小鼠腹腔B細(xì)胞體外與FITC標(biāo)記的60Co滅活金黃葡萄球菌共孵育（體外吞噬實(shí)驗(yàn)）8小時(shí)，以不同劑量秋水仙堿及細(xì)胞松弛素B等肌動(dòng)蛋白抑制劑干預(yù)，流式檢測(cè)吞噬率變化。結(jié)果顯示肌動(dòng)蛋白抑制劑可以劑量依賴性的抑制B細(xì)胞的吞噬率，提示B細(xì)胞吞噬過(guò)程需依賴肌動(dòng)蛋白重構(gòu)。 3）B細(xì)胞吞噬溶酶體形成觀察：以熒光微球行在體吞噬實(shí)驗(yàn)后，取腹腔B細(xì)胞甩片，行酸性磷酸酶染色后以熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示被內(nèi)吞的熒光微球均與溶酶體相結(jié)合或被溶酶體完全包裹，提示吞噬性B細(xì)胞有正常的吞噬溶酶體形成機(jī)制。 4）B細(xì)胞殺菌能力分析：取腹腔B細(xì)胞體外與預(yù)先涂板計(jì)數(shù)過(guò)活金葡菌共孵育，慶大霉素保護(hù)法檢測(cè)胞內(nèi)菌在不同孵育時(shí)間后的存活量。發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞內(nèi)吞菌量相對(duì)有限，但殺菌效率與其他吞噬細(xì)胞接近。 5）吞噬性B細(xì)胞表型特征分析：以金葡菌行B細(xì)胞體外吞噬實(shí)驗(yàn)后熒光標(biāo)記CD19、CD11b、CD5、B220（CD45Ro）等表型后行流式檢測(cè)。結(jié)果顯示吞噬性B細(xì)胞以CD11b~+B220~(low)的B-1細(xì)胞為主，其中CD5的B-1b細(xì)胞吞噬能力強(qiáng)于CD5~+的B-1a細(xì)胞。 6）B細(xì)胞吞噬受體分析：比較野生型鼠與TgV_H3B4鼠B細(xì)胞吞噬率；以不同濃度肌動(dòng)蛋白（TgV_H3B4鼠BCR交叉識(shí)別抗原之一）干預(yù)抗原競(jìng)爭(zhēng)阻斷B細(xì)胞體外吞噬實(shí)驗(yàn)，以抗CD11b、TLRs、IgM等的各種抗體干預(yù)野生型小鼠B細(xì)胞體外吞噬，并分析吞噬率不同。結(jié)果顯示阻斷CD11b分子及TLR2等均不能阻斷B細(xì)胞對(duì)金葡菌的吞噬，聯(lián)合運(yùn)用抗IgM重鏈及輕鏈抗體可有效阻斷B細(xì)胞對(duì)金葡菌的吞噬；TgV_H3B4鼠腹腔B細(xì)胞吞噬率高于野生型鼠；且肌動(dòng)蛋白可競(jìng)爭(zhēng)抑制TgV_H3B4鼠腹腔B細(xì)胞對(duì)金葡菌的吞噬；這些均提示BCR充當(dāng)了重要的吞噬受體。 7）吞噬性B細(xì)胞遷徙分析：在體吞噬實(shí)驗(yàn)不同時(shí)長(zhǎng)后收獲腹腔細(xì)胞流式分析B細(xì)胞吞噬率變化，結(jié)合CD11b染色分析表型分布，并取大網(wǎng)膜壓片及脾臟冰凍切片熒光標(biāo)記CD19后熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示腹腔吞噬性B細(xì)胞數(shù)量在1小時(shí)之內(nèi)迅速下降；1小時(shí)及1天之內(nèi)大網(wǎng)膜和脾臟中可見(jiàn)攜帶金葡菌的B細(xì)胞出現(xiàn)，，隨時(shí)間延長(zhǎng)而增多；CD11b分子可促進(jìn)遷徙；可見(jiàn)吞噬性B細(xì)胞可迅速經(jīng)大網(wǎng)膜向脾臟等次級(jí)淋巴器官遷徙。 8）T細(xì)胞激活試驗(yàn)：B細(xì)胞體外吞噬滅活金葡菌后與CFSE標(biāo)記的脾臟T細(xì)胞共孵育，5天后熒光標(biāo)記CD4，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)增殖反應(yīng)。結(jié)果顯示吞噬性B細(xì)胞可引起抗原特異性的脾臟CD4+T細(xì)胞增殖反應(yīng)，可見(jiàn)吞噬性B細(xì)胞可完成抗原呈遞。 主要結(jié)論： 本研究首次揭示了哺乳動(dòng)物B細(xì)胞的吞噬能力，其吞噬具有肌動(dòng)蛋白依賴性，能夠通過(guò)吞噬溶酶體機(jī)制等殺傷內(nèi)吞的細(xì)菌，符合經(jīng)典吞噬機(jī)制的特征；吞噬性B細(xì)胞具有CD11b介導(dǎo)的活躍的遷徙活動(dòng)，并能夠引起抗原特異性的CD4+T細(xì)胞增殖反應(yīng)；BCR參與并促進(jìn)了吞噬。本研究進(jìn)一步提示B-1細(xì)胞在演化上與吞噬細(xì)胞關(guān)系密切。B細(xì)胞吞噬參與了抗原提呈反應(yīng)，說(shuō)明B細(xì)胞具有針對(duì)顆粒抗原適應(yīng)性免疫應(yīng)答的免疫始動(dòng)能力。本研究有望為防治感染性疾病的疫苗開(kāi)發(fā)提供新策略，并為過(guò)敏性疾病、免疫相關(guān)性疾病的免疫治療提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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2 宋媛;徐少勇;周潔;高彬;付建芳;邢影;姬秋和;;高表達(dá)胰島素反應(yīng)性天然自身抗體轉(zhuǎn)基因小鼠糖耐量分析[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年09期

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1 鄭力強(qiáng);天然抗角蛋白自身抗體在病理性自身免疫中的作用及機(jī)制的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2007年

2 陳新輝;天然抗體IgM 3B4體外抑制白念珠菌與宿主細(xì)胞相互作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

3 周瀾華;抗白念珠菌人鼠嵌合抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

4 馬小瑩;B-1 B細(xì)胞表面吞噬相關(guān)分子分析[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2538891