【摘要】：背景： 晚期糖基化產(chǎn)物(Advanced glycation end products, AGEs)是非酶糖化反應的終末期產(chǎn)物,正常人隨著年齡的增加,AGEs會緩慢增加,但糖尿病病人由于長期高血糖狀態(tài),導致體內(nèi)糖化反應及AGEs生成加速。已有多項研究表明AGEs是引起糖尿病血管并發(fā)癥的重要誘因之一。AGEs能夠在糖尿病病人血管壁沉積,促進內(nèi)皮細胞凋亡和血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖,從而加速動脈粥樣硬化的形成。自噬是一種溶酶體依賴的細胞內(nèi)受損細胞器或代謝產(chǎn)物的降解過程,其作為細胞的防御保護機制,與細胞凋亡之間有密不可分的聯(lián)系。但關(guān)于AGEs與自噬之間可能存在的病理生理關(guān)系,目前尚不清楚。本文研究以研究自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達作為衡量自噬水平的主要指標,初步研究了AGEs誘導平滑肌細胞自噬的相關(guān)機制及其在AGEs誘導平滑肌細胞增殖中的作用。為臨床上防治糖尿病合并動脈粥樣硬化開辟新的途徑。 目的： 明確自噬機制在AGEs誘導的血管平滑肌細胞增殖過程中的作用。探討AGEs誘導血管平滑肌細胞自噬的相關(guān)信號通路機制以及晚期糖基化產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)在其中的作用。 方法： Western Blotting檢測AGEs處理大鼠血管平滑肌細胞A7R5后自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ, MAPK通路相關(guān)蛋白,Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白,RAGE的表達,免疫熒光檢測AGEs處理A7R5細胞后自噬相關(guān)蛋白LC3的表達,電鏡技術(shù)檢測AGEs處理A7R5細胞后自噬體的表達。四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測平滑肌細胞的增殖,RAGE小干擾RNA (siRNA)轉(zhuǎn)染前后A7R5細胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達變化。 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料實驗數(shù)據(jù)以x±s表示,數(shù)據(jù)錄入SPSS17.0完成統(tǒng)計分析,兩組之間比較采用配對t檢驗,組間比較采用one-way ANOVA。以P0.05為有統(tǒng)計學差異,P0.01為有顯著統(tǒng)計學差異。 結(jié)果： AGEs處理VSMCs后,自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達顯著上調(diào)并呈時間濃度依賴性,電鏡觀察到細胞內(nèi)自噬體數(shù)量增加,免疫熒光觀察到胞漿內(nèi)出現(xiàn)LC3顆粒；與對照組比較,AGEs處理組平滑肌細胞增殖能力增加,自噬抑制劑3-MA預處理的AGEs組細胞增殖能力被抑制。AGEs能夠激活ERK,JNK, P38的磷酸化水平,同時抑制Akt, mTOR的磷酸化水平。分別使用ERK抑制劑PD98059, JNK抑制劑SB203580, P38抑制劑SP600125, Akt激活劑IGF-1預處理后,只有PD98059預處理組和IGF-1預處理組能夠抑制AGEs誘導的平滑肌細胞自噬。用RAGE-siRNA干擾A7R5細胞RAGE的表達后,AGEs誘導的平滑肌細胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達增高現(xiàn)象被抑制。 結(jié)論： 本實驗以大鼠血管平滑肌細胞系A7R5為對象,研究AGEs對血管平滑肌細胞自噬水平產(chǎn)生的影響。AGEs通過ERK和Akt依賴的信號通路誘導的自噬參與了AGEs誘導的血管平滑肌細胞增殖。對AGEs-RAGE-自噬通路進行調(diào)節(jié)可能是預防糖尿病病人動脈粥樣硬化的潛在治療靶點。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363.2

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本文編號：2527434