【摘要】：目的：哺乳動(dòng)物胚胎植入是妊娠成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。小鼠胚胎植入及胎盤形成的的主要步驟包括：胚泡滋養(yǎng)外胚層粘附于子宮內(nèi)膜腔上皮；滋養(yǎng)層增殖進(jìn)而穿過腔上皮；圍繞胚泡粘附周圍的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖分化為蛻膜細(xì)胞；滋養(yǎng)層分化并具備侵襲表型，穿過子宮蛻膜組織，進(jìn)入母體血管；最后形成功能性的胎盤。在這一過程中，子宮內(nèi)膜蛻膜化及滋養(yǎng)層對(duì)蛻膜組織的適度侵襲對(duì)妊娠的建立和維持至關(guān)重要，因此也成為研究熱點(diǎn)。 最初作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)展開研究的γ-氨基丁酸，它的主要功能在于傳遞抑制性的神經(jīng)信號(hào)，具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、降血壓的生理作用，現(xiàn)已被開發(fā)合成口服制劑，用于醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)等，且表現(xiàn)出一定的生產(chǎn)價(jià)值。γ-氨基丁酸可作為胃腸肽，促進(jìn)胃液和生長(zhǎng)激素的分泌，興奮動(dòng)物的采食中樞，從而增加采食量；同時(shí)還可以減少動(dòng)物的無意識(shí)運(yùn)動(dòng)，以減少能量消耗，從而達(dá)到促生長(zhǎng)的目的。近年來，關(guān)于γ-氨基丁酸在外周組織中的調(diào)節(jié)作用備受關(guān)注，尤其是在熱點(diǎn)問題之一腫瘤的研究中。γ-氨基丁酸及其受體特異性表達(dá)于外周多種內(nèi)分泌組織和器官腫瘤，并表現(xiàn)出調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。而在生殖領(lǐng)域的研究中，早期的研究報(bào)道了，γ-氨基丁酸的A型受體π亞基扮演著重要角色。孕激素及其代謝中間物四氫孕酮能通過π亞基抑制子宮平滑肌的收縮,維持足月妊娠。在大鼠, π亞基在分娩啟動(dòng)前一直保持高水平,而在D19.5日和分娩過程中含量急劇下降,導(dǎo)致子宮對(duì)四氫孕酮的敏感性減弱,從而解除四氫孕酮對(duì)子宮靜息狀態(tài)的維持,促使分娩的啟動(dòng)。 在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎植入前期（D1-D4），GABA及其A受體π亞基，B受體B1亞基均動(dòng)態(tài)表達(dá)于子宮腔、腺上皮，并參與了囊胚脫帶及外延生長(zhǎng)，提示其參與植入前的母體-胚胎對(duì)話。在本實(shí)驗(yàn)中，我們研究了GABA信號(hào)在小鼠子宮D5-D8中的表達(dá)，并探討了GABA信號(hào)對(duì)蛻膜化進(jìn)程的影響及在早期滋養(yǎng)層侵襲中的作用。該研究將為闡明哺乳動(dòng)物胚胎著床的分子機(jī)制補(bǔ)充新的依據(jù)，同時(shí)為中樞神經(jīng)遞質(zhì)在生殖領(lǐng)域的研究提供新的視野。 第一部分GABA信號(hào)在圍植入期小鼠子宮的表達(dá)目的：檢測(cè)GABA、GABRP及GB1在圍植入期小鼠子宮的含量及動(dòng)態(tài)變化。方法：提取總RNA，兩步法RT-PCR檢測(cè)妊娠小鼠D4-D8子宮中GABRP及GB1mRNA水平的表達(dá)；制作石蠟切片，采用免疫組化檢測(cè)妊娠小鼠D4-D8子宮中GABA、GABRP及GB1蛋白的表達(dá)；提取總蛋白，采用western blot檢測(cè)妊娠小鼠D4-D8子宮中GABRP及GB1蛋白水平的表達(dá)；比色法檢測(cè)妊娠小鼠D1-D8子宮中的GABA含量。結(jié)果：GABRP及GB1mRNA表達(dá)于D4-D8小鼠子宮。與D4比較，GABRPmRNA的表達(dá)水平在D5及D7植入位點(diǎn)處上升（P0.05），而在非植入位點(diǎn)之間表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。GABRP mRNA的表達(dá)水平在D6及D8非植入位點(diǎn)處顯著高于對(duì)應(yīng)的植入位點(diǎn)（P0.05）。在各植入位點(diǎn)中，與D4比較，GB1mRNA的表達(dá)水平僅在D5時(shí)表達(dá)升高（P0.05）。免疫組化結(jié)果顯示， GABA、GABRP及GB1均表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)。在D4，GABA、GABRP及GB1表達(dá)于小鼠子宮的腔、腺上皮，而GABA、GABRP還表達(dá)于基質(zhì)細(xì)胞。在D5，GABA、GABRP及GB1表達(dá)于小鼠子宮殘留的腔、腺上皮。在D6-D8，GABA、GABRP及GB1則逐漸出現(xiàn)在初級(jí)蛻膜帶及次級(jí)蛻膜帶的蛻膜細(xì)胞，且GB1還弱表達(dá)于D8的EPCs。Western blot結(jié)果顯示，GABRP及GB1蛋白表達(dá)于D4-D8小鼠子宮。在D4-D8中，GABRP蛋白在D5子宮的植入位點(diǎn)及非植入位點(diǎn)處表達(dá)均達(dá)最高峰，與D4比較，差異均具有極顯著性(P0.01)，但隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。GABRP蛋白在各非植入位點(diǎn)之間的表達(dá)水平與對(duì)應(yīng)植入位點(diǎn)之間無顯著差異。GB1蛋白在D7子宮的植入位點(diǎn)與非植入位點(diǎn)處表達(dá)均達(dá)最高峰，植入位點(diǎn)與D4比較，非植入位點(diǎn)與D5非植入位點(diǎn)比較，差異均具有顯著性(P 0.05)。比色法結(jié)果顯示，在植入早期（D1-D4），與D1比較，GABA含量D3時(shí)出現(xiàn)上調(diào)（P＜0.05），而在D4時(shí)出現(xiàn)下降趨勢(shì)。在植入期（D5-D8），GABA含量在D5植入位點(diǎn)處呈現(xiàn)出最大值，與D4比較，差異具有極顯著性（P＜0.01），隨后繼續(xù)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，且在D6-D8的非植入位點(diǎn)含量顯著高于對(duì)應(yīng)的植入位點(diǎn)處，差異具有極顯著性（P＜0.01）。結(jié)論：GABRP及GB1mRNA及蛋白動(dòng)態(tài)表達(dá)于圍植入期的小鼠子宮；GABA含量在圍植入期的小鼠子宮中呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)；GABA及GABRP主要定位于圍植入期D4-D8的小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞及蛻膜區(qū)域的蛻膜細(xì)胞；GB1主要定位于D6-D8的蛻膜區(qū)及D8的絨毛膜錐部位。 第二部分GABA信號(hào)在小鼠子宮蛻膜化進(jìn)程的功能研究 第一節(jié)GABA信號(hào)在小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞體外蛻膜化進(jìn)程的功能研究 目的：成功建立小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞體外人工誘導(dǎo)蛻膜化模型；檢測(cè)在蛻膜化過程中，GBARP及GB1mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化；研究GABA及其A受體對(duì)蛻膜化過程中細(xì)胞增殖、周期及凋亡情況的影響；研究細(xì)胞周期蛋白cyclinD3是否參與GABA及其A受體對(duì)蛻膜化過程的調(diào)節(jié)。方法：原代提取小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞，用抗基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin及上皮細(xì)胞標(biāo)志物cytokeratin抗體，鑒定基質(zhì)細(xì)胞純度并采用間接免疫熒光方法檢測(cè)GABA、GABRP在基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)；采用E2聯(lián)合P4方法誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生蛻膜化，并選取0h，24h，48h及72h4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采用western blot檢測(cè)蛻膜化標(biāo)志物PRL的表達(dá)，以鑒定蛻膜化體外模型是否建立成功；提取總RNA，兩步法RT-PCR檢測(cè)GABRP及GB1在0h，24h，48h及72h4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的mRNA表達(dá)水平變化；提取總蛋白，western blot檢測(cè)GABRP在0h，24h，48h及72h4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的蛋白表達(dá)水平變化；在誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化反應(yīng)的同時(shí)，分別加入GABA(1μM,10μM及100μM); GABA A受體激動(dòng)劑Muscimol (0.5μM,5μM及50μM);最佳作用濃度的GABA與不同濃度的GABAA受體拮抗劑S106(0.5μM,5μM及50μM)聯(lián)合處理，分別于處理后24h，48h，72h，采用MTS和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)基質(zhì)細(xì)胞增殖，周期分布及凋亡情況，western blot檢測(cè)細(xì)胞cyclinD3的表達(dá)變化情況。結(jié)果：本研究提取的小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)鑒定，細(xì)胞純度達(dá)95%以上，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；Western blot結(jié)果顯示，與0h比較，PRL蛋白表達(dá)水平隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)水平上調(diào)，其差異極有顯著性（P＜0.01），提示成功誘導(dǎo)小鼠基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化。RT-PCR結(jié)果顯示，與0h比較，GABRP的mRNA表達(dá)水平隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)下調(diào)，其差異有顯著性（P＜0.05）；間接免疫熒光結(jié)果顯示，GABA、GABRP蛋白主要定位于原代提取的基質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)；western blot結(jié)果顯示，與0h比較，GABRP的蛋白表達(dá)水平隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)下調(diào)，其差異有顯著性（P＜0.05）。MTS結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的48h及72h時(shí)，1μM GABA和5μM GABAAR激動(dòng)劑Muscimol顯著抑制細(xì)胞增殖（P0.05），而50μM S106能成功逆轉(zhuǎn)1μM GABA對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在48h時(shí)，1μM GABA及5μM Muscimol能顯著增加S期的細(xì)胞分布數(shù)量（P0.05），而50μMS106成功逆轉(zhuǎn)1μM GABA對(duì)細(xì)胞S期的影響；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在72h時(shí)，1μM GABA及5μM Muscimol能顯著增加細(xì)胞的凋亡數(shù)量（P0.05）；而50μM S106成功逆轉(zhuǎn)1μM GABA對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照比較，在誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的48h及72h時(shí)，1μM GABA及5μM Muscimol處理能顯著降低cyclinD3的表達(dá)（P0.05），而50μM S106成功逆轉(zhuǎn)1μM GABA對(duì)cyclinD3表達(dá)的下調(diào)作用。結(jié)論：體外成功誘導(dǎo)小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化反應(yīng)；GABA及GABRP主要定位在基質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)，并隨著蛻膜化進(jìn)程，GABRP的mRNA及蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。GABA可能通過GABA A受體抑制體外基質(zhì)細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，擾亂細(xì)胞周期分布，從而體外抑制蛻膜化過程，并且cyclinD3參與調(diào)節(jié)該行為。 第二節(jié)GABA在小鼠子宮體內(nèi)蛻膜化進(jìn)程的功能研究 目的：探討GABA對(duì)于小鼠子宮體內(nèi)蛻膜化進(jìn)程的影響。方法：于D5開始，分別腹腔注射0.05g/kg，0.5g/kg及5g/kg的GABA，每日1次，連續(xù)注射3日；于D8時(shí)處死小鼠，取出子宮，統(tǒng)計(jì)蛻膜鼓包的個(gè)數(shù)及稱重；隨后固定各處理組的蛻膜鼓包，進(jìn)行石蠟切片，隨后行HE染色，采用Image J軟件計(jì)算大核及多核的面積；采用western blot檢測(cè)蛻膜化標(biāo)志物PRL在各組D8子宮植入位點(diǎn)處的表達(dá)。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，0.05g/kg及5g/kgGABA組可顯著減少蛻膜鼓包的數(shù)量（P＜0.05），同時(shí)，0.5g/kgGABA可減輕蛻膜鼓包重量（P＜0.05）；通過ImageJ軟件計(jì)算面積可知，與空白組比較，0.05g/kg及0.5g/kgGABA顯著降低大核多核區(qū)域面積（P＜0.05）；western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，各濃度組的GABA均能顯著降低PRL的表達(dá)量，其差異具有顯著性（P＜0.05）。結(jié)論：GABA可能通過減少蛻膜化的面積及降低蛻膜化反應(yīng)的強(qiáng)度，從而在體內(nèi)抑制小鼠子宮蛻膜化進(jìn)程。 第三部分GABA信號(hào)在小鼠早期滋養(yǎng)層侵襲中的功能初探 目的：研究GABA及其B受體對(duì)蛻膜細(xì)胞侵襲能力及絨毛膜錐(ectoplacental cones, EPCs)外延生長(zhǎng)能力的影響。方法：原代分離D8小鼠子宮蛻膜細(xì)胞，間接免疫熒光檢測(cè)GABA及GB1的表達(dá)；采用GABA(1μM,10μM及100μM); Baclofen(0.5μM,5μM及50μM；最佳作用濃度的GABA分別與2-Hydroxysaclofen(0.2μM,2μM及20μM)干預(yù)蛻膜細(xì)胞，transwell小室模型檢測(cè)蛻膜細(xì)胞侵襲能力的變化；原代分離EPCs，種于Matrigel膠上，采用采用GABA(1μM,10μM及100μM); Baclofen(0.5μM,5μM及50μM；最佳作用濃度的GABA分別與2-Hydroxysaclofen(0.2μM,2μM及20μM)干預(yù)，分別于24h，48h，72h觀察EPCs粘附及外延生長(zhǎng)情況，采用Image J軟件分析EPCs外延生長(zhǎng)能力的變化。結(jié)果：間接免疫熒光結(jié)果顯示，GABA及GB1表達(dá)于原代蛻膜細(xì)胞胞質(zhì)；采用transwell小室模型，計(jì)算下室細(xì)胞數(shù)量，統(tǒng)計(jì)分析可知，100μM GABA，5μM Baclofen減少下室細(xì)胞數(shù)量，提示其抑制蛻膜細(xì)胞的侵襲能力，，而20μM2-Hydroxysaclofen可逆轉(zhuǎn)100μM GABA對(duì)細(xì)胞侵襲的抑制作用；顯微鏡下觀察，不同處理組的EPCs均有90%以上的黏附率，其差無異顯著性，通過Image J軟件分析可知，在處理后的24h及48h時(shí)，100μM GABA及5μM Baclofen均可促進(jìn)EPCs的外延生長(zhǎng)(P 0.05)，而20μM2-Hydroxysaclofen可逆轉(zhuǎn)100μM GABA對(duì)EPCs外延生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。結(jié)論：GABA可能通過B受體促進(jìn)EPCs的外延生長(zhǎng)，從而表現(xiàn)為促進(jìn)滋養(yǎng)層侵襲至母體蛻膜組織；然而卻表現(xiàn)為抑制該過程中的蛻膜細(xì)胞的侵襲能力。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R321

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3 高飛;正常人群腦內(nèi)GABA含量與年齡相關(guān)性的磁共振波譜研究[D];山東大學(xué);2012年

4 許嬋娟;GABA_B受體神經(jīng)保功能的分子機(jī)制研究及其與G蛋白動(dòng)態(tài)相作用研究[D];華中科技大學(xué);2011年

5 伍國(guó)鋒;海馬電刺激對(duì)耐藥性癲癇大鼠腦組織GABA受體表達(dá)及鈉通道電流的影響[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

6 許嬋娟;GABA_B受體神經(jīng)保護(hù)功能的分子機(jī)制研究及其與G蛋白動(dòng)態(tài)相互作用研究[D];華中科技大學(xué);2011年

7 冉然;背根神經(jīng)節(jié)GABA_A受體調(diào)控對(duì)神經(jīng)痛的治療作用及其機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2011年

8 馬琳琳;孕激素不同種類及不同劑量對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)及出血有關(guān)基因表達(dá)影響的比較研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2010年

9 高尚鋒;神經(jīng)遞質(zhì)GABA和NO在抑郁癥患者和應(yīng)激模型中的病理意義[D];浙江大學(xué);2012年

10 羅彬;突觸前GABA_B受體的激活對(duì)大鼠內(nèi)側(cè)膝狀體突觸傳遞的調(diào)節(jié)作用[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 葉硯;高產(chǎn)γ-氨基丁酸紅曲菌種培育及深層發(fā)酵關(guān)鍵技術(shù)研究[D];浙江師范大學(xué);2010年

2 汪珍珍;同病異治復(fù)方對(duì)急性癲癇模型的作用及對(duì)PTZ點(diǎn)燃大鼠GABA傳導(dǎo)通路的影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

3 何婷;慢性應(yīng)激性抑郁發(fā)生與海馬Glu和GABA水平變化及其受體機(jī)制[D];陜西師范大學(xué);2011年

4 康艷偉;GABA-R與Glu-R在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生中作用機(jī)制的研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2011年

5 王建剛;Securinine作為GABA_A受體拮抗劑的離子作用機(jī)制[D];青島大學(xué);2004年

6 趙文靜;γ-氨基丁酸對(duì)蛋鴿產(chǎn)蛋性能的影響及其機(jī)理研究[D];浙江大學(xué);2010年

7 肖奕;激動(dòng)GABA_c受體對(duì)大鼠癲癇發(fā)作及腦內(nèi)GABA、GAT1和ρ2mRNA表達(dá)的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

8 徐曉波;產(chǎn)生GABA酵母菌資源多樣性和分子系統(tǒng)學(xué)研究[D];浙江師范大學(xué);2010年

9 吳翠瑩;GABA能機(jī)制參與NRG-1的神經(jīng)保護(hù)作用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

10 龍乾發(fā);體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向GABA能神經(jīng)元分化[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2524799