【摘要】：嚙齒動物著床后體外全胚胎培養(yǎng)（Whole Embryo Culture，WEC）方法的研究和作為發(fā)育毒性實驗系統(tǒng)的應(yīng)用研究已有三十余年，現(xiàn)已經(jīng)通過了歐洲替代方法驗證中心（ECVAM）驗證，表明其與體內(nèi)結(jié)果有良好的一致性，被推薦為發(fā)育毒性的替代方法之一。而兔全胚胎培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用相對就滯后很多，近年才在方法學有明顯突破。有研究資料顯示兔全胚胎培養(yǎng)模型在發(fā)育毒性研究的某些方面可能優(yōu)于嚙齒類動物，現(xiàn)行發(fā)育毒性實驗指南中通常要求實驗動物需包括嚙齒類和非嚙齒類動物，而兔是非嚙齒類的首選動物。因此，無論作為發(fā)育毒性研究，還是發(fā)展替代方法，無疑兔全胚胎體外培養(yǎng)模型都具有重要的發(fā)展應(yīng)用前景。而國內(nèi)還未見建立兔全胚胎培養(yǎng)研究的報道。為此，本研究的目的之一是引進建立兔全胚胎培養(yǎng)模型，并試用于發(fā)育毒性研究。 納米材料由于特有的理化和生物學性質(zhì)，有廣泛的應(yīng)用價值，但也因為與非納米材料性質(zhì)的差異，是否會給生產(chǎn)者和使用者造成未知的健康危害成為人們關(guān)注的重要問題。發(fā)育毒性是各類化學物安全性評價或危險度評估的重要內(nèi)容之一，現(xiàn)行評價方法是否適合納米材料的評價是亟待回答的問題。為此，本研究選擇三類納米材料（金屬氧化物類、碳納米管類、有機物）的代表物，利用小鼠全胚胎培養(yǎng)模型研究其發(fā)育毒性，并比較了Nano-TiO_2對小鼠和兔的體外發(fā)育毒性，目的是揭示納米材料胚胎發(fā)育毒性的特征，為評估現(xiàn)行方法是否適用于納米材料的決策提供科學依據(jù)。 本文研究內(nèi)容分以下三部分。 一、兔著床后全胚胎培養(yǎng)模型的建立及其驗證 采用新西蘭孕兔，取GD9孕兔胚胎，參照Carney和Naya的方法稍加修改，主要是在打開子宮壁時改用了從中間向兩邊切開子宮的方法。剝離胚胎后單瓶培養(yǎng)，形態(tài)學評分系統(tǒng)采用Carney建立的兔胚胎形態(tài)評分系統(tǒng)。體外培養(yǎng)48h后將觀察結(jié)果與文獻報道的結(jié)果進行對比；并用5.0mmol/L濃度的甲氧基乙酸（MAA）作為陽性對照物對所建培養(yǎng)方法作進一步驗證。 研究結(jié)果顯示，本研究中23個GD9天齡兔胚胎體外培養(yǎng)48h后，存活率為100%，頭長平均增長2.15倍，卵黃囊閉合和胚胎彎曲情況、體節(jié)數(shù)、自發(fā)畸形率、形態(tài)評分均數(shù)等指標均與文獻報道的體外培養(yǎng)發(fā)育情況相近。5.0mmol/L濃度的陽性對照MAA能引起兔胚胎明顯的發(fā)育毒性，包括卵黃囊閉合減少、頭部區(qū)域腫脹、面部器官缺失、體節(jié)紊亂、尾神經(jīng)管閉合不全等，形態(tài)總評分明顯低于溶劑對照（P0.05），畸形率為88.24%，畸形類型和畸形率與文獻報道一致。結(jié)果表明本研究所建立的兔著床后全胚胎培養(yǎng)方法是成功的。 二、三種納米材料對體外小鼠胚胎生長發(fā)育的影響 取GD8.5的ICR小鼠胚胎，采用小鼠WEC方法，分別用60nm二氧化鈦、60nm聚苯乙烯以及不規(guī)則形狀的單壁碳納米管在64.0、160.0、400.0μg/mL劑量下培養(yǎng)48h后收獲胚胎，解剖鏡下觀察監(jiān)測終點,采用Van小鼠胚胎發(fā)育評分法對小鼠胚胎進行評分，研究其對小鼠體外胚胎的生長發(fā)育影響。 1.納米二氧化鈦（Nano-TiO_2） Nano-TiO_2在受試濃度下，卵黃囊直徑、胚胎顱臀長、頭長三項生長指標和體節(jié)數(shù)與對照組間沒有明顯差異，但畸形率與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P0.05），而且隨著劑量增加畸形率升高，有明顯的劑量-反應(yīng)趨勢。在64.0μg/mL濃度開始就觀察到胚胎出現(xiàn)發(fā)育毒性表現(xiàn)，卵黃囊血循環(huán)、體位、心臟、尾神經(jīng)管、中腦、后肢的評分低于對照組（P0.05）；中劑量組進一步出現(xiàn)后腦發(fā)育較差，評分低于對照組（P0.05）；高劑量組除上述組織器官外，頭部視覺和嗅覺器官評分明顯低于其他各組，而且總形態(tài)學評分低于其余各組，與對照組相比有統(tǒng)計學差異（P0.05）。表明隨著劑量增加，受影響的胚胎組織器官增多；胚胎組織器官形態(tài)分化的受影響程度也有一定加重。 2.納米聚苯乙烯（Nano-PS） 60nm Nano-PS在64.0、160.0、400.0μg/mL三種濃度下對小鼠胚胎各生長指標情況沒有出現(xiàn)明顯的影響；畸形率有增加但與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；各劑量組形態(tài)學分化評分均低于對照組但沒有統(tǒng)計學差異，主要影響心臟、腦、聽覺器官及后肢。 3.單壁碳納米管（SWCNTs） 單壁碳納米管在64.0、160.0、400.0μg/mL受試劑量下，中劑量組嚴重影響小鼠胚胎體節(jié)發(fā)育，形態(tài)學分化評分也明顯降低，畸形發(fā)生明顯高于其他劑量組，多個器官出現(xiàn)畸形。出現(xiàn)的發(fā)育毒性主要表現(xiàn)為：卵黃囊循環(huán)血管發(fā)育較差、體位翻轉(zhuǎn)不全、體節(jié)紊亂、心包積液或發(fā)育不良、聽覺視覺鰓弓發(fā)育不良、后肢芽缺失。低劑量和高劑量組的生長發(fā)育指標和組織器官形態(tài)分化指標與對照組沒有統(tǒng)計學差異。 4.三種納米材料對小鼠發(fā)育毒性的比較 Nano-TiO_2在64.0μg/mL濃度開始就觀察到胚胎出現(xiàn)發(fā)育毒性；單壁碳納米管在160.0μg/mL劑量下出現(xiàn)胚胎發(fā)育毒性；而Nano-PS在受試劑量下能明顯影響少數(shù)器官。從致畸性來說，Nano-TiO_2在64.0μg/mL濃度就開始與對照組有統(tǒng)計學差異，并有明顯的劑量-反應(yīng)趨勢；單壁碳納米管僅在160.0μg/mL劑量組與對照組有統(tǒng)計學差異，無明顯劑量-反應(yīng)趨勢，但致畸發(fā)生率和致畸嚴重程度均比Nano-TiO_2高。從致畸類型來說，Nano-TiO_2明顯影響卵黃囊循環(huán)，主要引起中腦、心臟、視覺、嗅覺器官和尾神經(jīng)管畸形，60nm PS主要影響心臟、腦、聽覺器官及后肢，SWCNTs能引起幾乎所有的器官畸形，包括腦部、心臟、面部器官、尾神經(jīng)管等。 三、納米二氧化鈦對小鼠和兔體外胚胎發(fā)育毒性的比較 Nano-TiO_2在160.0、400.0、1000.0μg/mL劑量下對兔胚胎頭長、體節(jié)數(shù)的生長發(fā)育情況沒有出現(xiàn)明顯的影響，160.0、400.0μg/mL劑量畸形率與對照組有統(tǒng)計學差異，無明顯劑量-反應(yīng)關(guān)系趨勢；各組的形態(tài)學評分均低于對照組，但均無統(tǒng)計學差異。而小鼠各劑量組畸形率與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P0.05）；從致畸類型和受影響的組織器官兔和小鼠相近，但小鼠受影響的組織器官更多。通過研究，主要獲得以下成果： 結(jié)論： （1）在國內(nèi)首先成功引進建立了兔著床后全胚胎培養(yǎng)方法。 （2）三類納米材料均不影響小鼠胚胎存活，對胚胎生長指標沒有明顯影響，但Nano-TiO_2在64.0μg/mL濃度就可引起體外小鼠胚胎致畸等發(fā)育毒性，并有明顯的劑量-反應(yīng)趨勢；SWNCT在160.0μg/mL劑量可引起胚胎發(fā)育毒性，無明顯劑量-反應(yīng)趨勢，但致畸發(fā)生率和致畸嚴重程度均比Nano-TiO_2高；而Nano-PS在受試劑量下僅對形態(tài)分化有一定遲緩作用，其發(fā)育毒性有待進一步驗證。 （3）Nano-TiO_2在受試劑量下均可引起兔和小鼠體外胚胎致畸等發(fā)育毒性，毒作用特點相近，，但從發(fā)生率和引起毒性的劑量及嚴重性上小鼠比兔似更敏感。
【圖文】：

兔著床后全胚胎培養(yǎng)方法和三種納米材料對小鼠體外發(fā)育毒性的研究有卵黃囊外周血管圍繞并且有心跳的胚胎進行分離。用虹膜剪將與外周血管連接的遠端組織剪斷，然后用鈍的顯微鑷小心將帶有卵黃囊的胚胎從胎盤上分離出來，無菌玻璃吸管將帶羊膜和卵黃囊的胚胎轉(zhuǎn)移到干凈的 Hank’s 中清洗，并在顯微鏡下仔細檢查，記錄頭長，選擇有 12-14 體節(jié)，外周血管和內(nèi)臟卵黃囊未被機械性損傷的胚胎進行培養(yǎng)，隨機分到各組，將胚胎移入 50mL 培養(yǎng)瓶中，每瓶一個，加入 3mL 培養(yǎng)液，把培養(yǎng)瓶置于恒溫旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱，在 38℃下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 48h，轉(zhuǎn)速 20～30r/min，分別在培養(yǎng)開始時充入混合氣體(5％CO2：20％O2：75％N2)、培養(yǎng) 18h、34h、44h 分別充入混合氣體(5％CO2：95％O2)一共四次，每次 2min（圖 1）。

C D圖 2 兔胚胎移植和培養(yǎng)e 2 Transfer and culture the rabbit embryos A.seperate the embryo; B.50mL cultbottle; C.fill the mixture gas; D.rotation culture離；B.50mL 培養(yǎng)瓶；C.充入氣體；D.旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、結(jié)果觀察養(yǎng) 48 h 后收獲胚胎，鏡下觀察存活和胚胎畸形情況并測量頭長。采用 Car兔胚胎形態(tài)評分系統(tǒng)[19]對兔胚胎器官形態(tài)分化進行評分。、致畸陽性物驗證甲氧基乙酸（MAA）用 Hank’s 液配成 100×的母液，培養(yǎng)前按照 1%體積加 中，終濃度為 5.0mmol/L，胚胎在含陽性物的 ICS 中培養(yǎng) 48h 后，觀察其對發(fā)育毒性，包括胚胎存活、頭長增長、畸形以及形態(tài)學發(fā)育情況（卵黃囊循
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R321

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 楊輝;劉超;;納米材料毒理學研究進展[J];軍事醫(yī)學科學院院刊;2007年03期

2 張華山;楊丹鳳;楊輝;張偉;劉煥亮;林治卿;林本成;襲著革;;氣管滴注納米材料對妊娠大鼠胚胎毒性影響的初步研究[J];南開大學學報(自然科學版);2008年03期

3 玉曉微;趙占克;韓冰;胡傳祿;楊旭;袁均林;;納米二氧化硅對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的初步研究[J];生態(tài)毒理學報;2009年05期

4 應(yīng)賢平;仲偉鑒;;納米二氧化鈦顆粒毒理學進展[J];毒理學雜志;2006年05期

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1 楊輝;典型納米材料胚胎毒性及其氧化應(yīng)激機制的初步研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2008年

本文編號：2518925