【摘要】：生命組織、細(xì)菌、病毒和病菌均具有獨(dú)特的核酸序列,這些特定序列的檢測(cè)在衛(wèi)生防疫、醫(yī)學(xué)診斷、藥物研究、環(huán)境科學(xué)及生物工程等領(lǐng)域起著重要作用。另外,生物樣品中某些蛋白質(zhì)濃度異常也是疾病發(fā)生的征兆,因此建立快速、準(zhǔn)確的生物大分子的分析方法十分必要。迄今為止檢測(cè)生物大分子的分析方法已有許多報(bào)道,其中,熒光分析法以其操作簡(jiǎn)單、無(wú)需底物和靈敏度高等優(yōu)勢(shì),應(yīng)用最為廣泛。熒光分析法中常用到的熒光標(biāo)記物包括有機(jī)熒光染料和新近發(fā)展的熒光納米粒子,這其中量子點(diǎn)的應(yīng)用發(fā)展非常迅速。相對(duì)于傳統(tǒng)的有機(jī)染料,量子點(diǎn)具有一些優(yōu)異的特性,使其在核酸和蛋白的分析檢測(cè)中常被用作熒光探針。鑒于目前生物大分子檢測(cè)的研究現(xiàn)狀,偶合量子點(diǎn)優(yōu)異的熒光特性,本論文發(fā)展了多種高靈敏度、高選擇性的生物大分子檢測(cè)新方法,主要研究?jī)?nèi)容分為三個(gè)部分： 1本部分實(shí)驗(yàn)發(fā)展了一種新穎的鏈?zhǔn)诫s交反應(yīng)模式,即以捕獲探針為循環(huán)雜交反應(yīng)的觸發(fā)器,報(bào)告探針和目標(biāo)序列之間交替互補(bǔ),隨后結(jié)合量子點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了單組分DNA的高靈敏度檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中采用報(bào)告探針?lè)謩e結(jié)合捕獲探針和目標(biāo)序列的模式,將捕獲探針和報(bào)告探針進(jìn)行了特殊設(shè)計(jì),在報(bào)告探針和目標(biāo)序列、捕獲探針雜交后,目標(biāo)序列一端會(huì)裸露部分與捕獲探針相同的堿基,從而使其它的報(bào)告探針會(huì)繼續(xù)與之雜交,而體系中另外的目標(biāo)序列也會(huì)再與報(bào)告探針雜交,以此循環(huán),形成高分子量的DNA雙鏈聚合體,建立了信號(hào)放大模式。此方法在檢測(cè)DNA分子方面具有優(yōu)異的性能,靈敏度高(10fM),對(duì)堿基的錯(cuò)配、空缺和插入的識(shí)別能力強(qiáng)。 在建立了鏈?zhǔn)诫s交反應(yīng)結(jié)合量子點(diǎn)檢測(cè)特定序列DNA的方法后,第二節(jié)進(jìn)一步將此技術(shù)拓展到蛋白質(zhì)的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)采用環(huán)狀DNA分子作為循環(huán)雜交底物,結(jié)合適配體識(shí)別技術(shù),建立了檢測(cè)血小板衍生生長(zhǎng)因子PDGF-BB的新方法。PDGF-BB是血清中由多種細(xì)胞所產(chǎn)生的能刺激平滑肌細(xì)胞、膠質(zhì)等細(xì)胞增生的一種多肽,具有廣泛的生理活性。PDGF-BB作為PDGF的重要亞型之一,近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其含量對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤生長(zhǎng)有直接的影響,故對(duì)PDGF-BB的檢測(cè)在生物學(xué)上有重要的意義。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)體系中兩個(gè)存在互補(bǔ)堿基的生物素化發(fā)卡DNA分子由于其自身環(huán)的“鎖”功能,不能進(jìn)行雜交；而引入適配體后,與其中一條DNA分子雜交,并將其開(kāi)環(huán)成為直鏈,引發(fā)兩個(gè)DNA分子之間循環(huán)雜交。在此實(shí)驗(yàn)中,每個(gè)適配體分子會(huì)觸發(fā)一個(gè)鏈?zhǔn)诫s交反應(yīng),使大量的生物素化的DNA分子凝聚在一起,結(jié)合鏈霉親和素量子點(diǎn)形成適配體-量子點(diǎn)復(fù)合物。隨后將適配體-量子點(diǎn)復(fù)合物加入到已結(jié)合有抗原的微孔中,適配體與抗原結(jié)合,通過(guò)檢測(cè)量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度即可確定蛋白質(zhì)的含量。與非HCR模式相比,該方法信號(hào)放大效果明顯,靈敏度顯著提高,選擇性好,并可對(duì)真實(shí)樣品進(jìn)行快速準(zhǔn)確地測(cè)定。與傳統(tǒng)的ELISA法相比,該方法更為簡(jiǎn)便可控,原材料更加穩(wěn)定。 2在以上單組分DNA和蛋白質(zhì)檢測(cè)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步將方法拓展至雙組分的同時(shí)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)采用量子點(diǎn)標(biāo)記寡核苷酸解鏈溫度增強(qiáng)的原理,實(shí)現(xiàn)了雙組分小RNA分子的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中對(duì)捕獲探針、報(bào)告探針和目標(biāo)序列在不同的結(jié)合方式下溫度的影響進(jìn)行了考察,結(jié)果表明在報(bào)告探針先與量子點(diǎn)結(jié)合后,再與目標(biāo)序列和捕獲探針雜交時(shí)可達(dá)到與連接酶存在時(shí)同樣的效果,即增強(qiáng)了雙鏈DNA的穩(wěn)定性,解鏈溫度得到提高。選擇兩個(gè)不同粒徑的量子點(diǎn)標(biāo)記對(duì)應(yīng)的報(bào)告探針,僅需一步雜交反應(yīng)即可將體系中三個(gè)部分DNA、RNA和量子點(diǎn)結(jié)合,無(wú)需酶的使用即可對(duì)多個(gè)組分進(jìn)行同時(shí)測(cè)定,并為短鏈核酸的分析提供了新的思路。 為了進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度,將層層組裝的概念引入,以聚苯乙烯微球?yàn)楹诵?利用鏈霉親和素和生物素的高度親和性將量子點(diǎn)層層組裝至微球表面,最后結(jié)合可與目標(biāo)序列雜交的報(bào)告探針,建立了一個(gè)目標(biāo)分子對(duì)應(yīng)多個(gè)熒光標(biāo)記物的信號(hào)放大模式�；诹孔狱c(diǎn)激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄的特性,選用了兩個(gè)不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn),使用同一激發(fā)波長(zhǎng)即可對(duì)雙組分DNA(HIV-1,HIV-2)進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè)。與未放大的方法比較,此方法靈敏度提高了100倍。 3在熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系中,為了避免光譜重疊或信號(hào)干擾,量子點(diǎn)常被用作供體或受體。本部分實(shí)驗(yàn)將量子點(diǎn)作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移中的供體,在夾心反應(yīng)和均相體系競(jìng)爭(zhēng)模式中,量子點(diǎn)均能與受體熒光染料Cy5之間通過(guò)DNA的雜交作用實(shí)現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移,從而對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)首先對(duì)量子點(diǎn)和Cy5在載體上和均相溶液中的能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象進(jìn)行了考察,并進(jìn)一步引入酶切循環(huán)放大的概念,采用“Y”型DNA分子結(jié)合方式,即三條DNA序列同時(shí)存在時(shí)DNA雙鏈才能形成,并激活限制性內(nèi)切酶,將其中一條分支切斷,使受體與供體分離,并釋放出目標(biāo)序列,與其它輔助序列繼續(xù)雜交,導(dǎo)致FRET信號(hào)的明顯變化,建立了高靈敏度、高選擇性的FRET-DNA檢測(cè)方式。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R341

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 孫寶全,徐詠藍(lán),衣光舜,陳德樸;半導(dǎo)體納米晶體的光致發(fā)光特性及在生物材料熒光標(biāo)記中的應(yīng)用[J];分析化學(xué);2002年09期

2 朱靜;黃勇;蔣小平;譚鐘揚(yáng);蔣健暉;沈國(guó)勵(lì);俞汝勤;;基于核酸適配體-質(zhì)粒DNA復(fù)合物信號(hào)放大的熒光免疫傳感技術(shù)[J];分析化學(xué);2009年11期

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本文編號(hào)：2497125