【摘要】：生命組織、細菌、病毒和病菌均具有獨特的核酸序列,這些特定序列的檢測在衛(wèi)生防疫、醫(yī)學(xué)診斷、藥物研究、環(huán)境科學(xué)及生物工程等領(lǐng)域起著重要作用。另外,生物樣品中某些蛋白質(zhì)濃度異常也是疾病發(fā)生的征兆,因此建立快速、準確的生物大分子的分析方法十分必要。迄今為止檢測生物大分子的分析方法已有許多報道,其中,熒光分析法以其操作簡單、無需底物和靈敏度高等優(yōu)勢,應(yīng)用最為廣泛。熒光分析法中常用到的熒光標記物包括有機熒光染料和新近發(fā)展的熒光納米粒子,這其中量子點的應(yīng)用發(fā)展非常迅速。相對于傳統(tǒng)的有機染料,量子點具有一些優(yōu)異的特性,使其在核酸和蛋白的分析檢測中常被用作熒光探針。鑒于目前生物大分子檢測的研究現(xiàn)狀,偶合量子點優(yōu)異的熒光特性,本論文發(fā)展了多種高靈敏度、高選擇性的生物大分子檢測新方法,主要研究內(nèi)容分為三個部分： 1本部分實驗發(fā)展了一種新穎的鏈式雜交反應(yīng)模式,即以捕獲探針為循環(huán)雜交反應(yīng)的觸發(fā)器,報告探針和目標序列之間交替互補,隨后結(jié)合量子點,實現(xiàn)了單組分DNA的高靈敏度檢測。本實驗中采用報告探針分別結(jié)合捕獲探針和目標序列的模式,將捕獲探針和報告探針進行了特殊設(shè)計,在報告探針和目標序列、捕獲探針雜交后,目標序列一端會裸露部分與捕獲探針相同的堿基,從而使其它的報告探針會繼續(xù)與之雜交,而體系中另外的目標序列也會再與報告探針雜交,以此循環(huán),形成高分子量的DNA雙鏈聚合體,建立了信號放大模式。此方法在檢測DNA分子方面具有優(yōu)異的性能,靈敏度高(10fM),對堿基的錯配、空缺和插入的識別能力強。 在建立了鏈式雜交反應(yīng)結(jié)合量子點檢測特定序列DNA的方法后,第二節(jié)進一步將此技術(shù)拓展到蛋白質(zhì)的檢測。實驗采用環(huán)狀DNA分子作為循環(huán)雜交底物,結(jié)合適配體識別技術(shù),建立了檢測血小板衍生生長因子PDGF-BB的新方法。PDGF-BB是血清中由多種細胞所產(chǎn)生的能刺激平滑肌細胞、膠質(zhì)等細胞增生的一種多肽,具有廣泛的生理活性。PDGF-BB作為PDGF的重要亞型之一,近年來研究發(fā)現(xiàn)其含量對細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤生長有直接的影響,故對PDGF-BB的檢測在生物學(xué)上有重要的意義。實驗設(shè)計體系中兩個存在互補堿基的生物素化發(fā)卡DNA分子由于其自身環(huán)的“鎖”功能,不能進行雜交；而引入適配體后,與其中一條DNA分子雜交,并將其開環(huán)成為直鏈,引發(fā)兩個DNA分子之間循環(huán)雜交。在此實驗中,每個適配體分子會觸發(fā)一個鏈式雜交反應(yīng),使大量的生物素化的DNA分子凝聚在一起,結(jié)合鏈霉親和素量子點形成適配體-量子點復(fù)合物。隨后將適配體-量子點復(fù)合物加入到已結(jié)合有抗原的微孔中,適配體與抗原結(jié)合,通過檢測量子點的熒光強度即可確定蛋白質(zhì)的含量。與非HCR模式相比,該方法信號放大效果明顯,靈敏度顯著提高,選擇性好,并可對真實樣品進行快速準確地測定。與傳統(tǒng)的ELISA法相比,該方法更為簡便可控,原材料更加穩(wěn)定。 2在以上單組分DNA和蛋白質(zhì)檢測的基礎(chǔ)上,進一步將方法拓展至雙組分的同時測定。實驗采用量子點標記寡核苷酸解鏈溫度增強的原理,實現(xiàn)了雙組分小RNA分子的測定。實驗中對捕獲探針、報告探針和目標序列在不同的結(jié)合方式下溫度的影響進行了考察,結(jié)果表明在報告探針先與量子點結(jié)合后,再與目標序列和捕獲探針雜交時可達到與連接酶存在時同樣的效果,即增強了雙鏈DNA的穩(wěn)定性,解鏈溫度得到提高。選擇兩個不同粒徑的量子點標記對應(yīng)的報告探針,僅需一步雜交反應(yīng)即可將體系中三個部分DNA、RNA和量子點結(jié)合,無需酶的使用即可對多個組分進行同時測定,并為短鏈核酸的分析提供了新的思路。 為了進一步提高檢測靈敏度,將層層組裝的概念引入,以聚苯乙烯微球為核心,利用鏈霉親和素和生物素的高度親和性將量子點層層組裝至微球表面,最后結(jié)合可與目標序列雜交的報告探針,建立了一個目標分子對應(yīng)多個熒光標記物的信號放大模式�；诹孔狱c激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄的特性,選用了兩個不同發(fā)射波長的量子點,使用同一激發(fā)波長即可對雙組分DNA(HIV-1,HIV-2)進行高靈敏度的檢測。與未放大的方法比較,此方法靈敏度提高了100倍。 3在熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系中,為了避免光譜重疊或信號干擾,量子點常被用作供體或受體。本部分實驗將量子點作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移中的供體,在夾心反應(yīng)和均相體系競爭模式中,量子點均能與受體熒光染料Cy5之間通過DNA的雜交作用實現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移,從而對目標序列進行測定。實驗首先對量子點和Cy5在載體上和均相溶液中的能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象進行了考察,并進一步引入酶切循環(huán)放大的概念,采用“Y”型DNA分子結(jié)合方式,即三條DNA序列同時存在時DNA雙鏈才能形成,并激活限制性內(nèi)切酶,將其中一條分支切斷,使受體與供體分離,并釋放出目標序列,與其它輔助序列繼續(xù)雜交,導(dǎo)致FRET信號的明顯變化,建立了高靈敏度、高選擇性的FRET-DNA檢測方式。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R341

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：2497125