發(fā)布時間：2019-06-06 07:56

【摘要】：背景腦血管病的高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率、高死亡率對人類健康的危害依然高居前位。神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs)移植被認為是二十一世紀(jì)較具前景的醫(yī)療技術(shù),但因NSCs的來源受限、取材困難、免疫排斥、安全性和倫理學(xué)等眾多問題使神經(jīng)干細胞的應(yīng)用受到制約,尤其是神經(jīng)干細胞的來源和移植途徑成為制約其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。腦梗死后成體神經(jīng)干細胞的原位激活為內(nèi)源性神經(jīng)干細胞移植開辟了新途徑,其激活機制有待闡明,前期研究發(fā)現(xiàn)腦梗死后神經(jīng)干細胞原位激活與谷氨酸(glutamate, GLu)濃度有關(guān)聯(lián)。為此,本課題擬通過體外實驗,探討谷氨酸對大鼠神經(jīng)干細胞增殖作用的影響,為進一步研究內(nèi)源性神經(jīng)干細胞原位激活機制提供理論依據(jù)。 本課題分兩部分： 第一部分神經(jīng)干細胞的原代培養(yǎng)和鑒定方法的改良 目的體外原代培養(yǎng)SD (Sprague-Dawley)大鼠神經(jīng)干細胞,對原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞、及其增殖和分化的細胞給予鑒定,并對神經(jīng)干細胞原代培養(yǎng)和鑒定方法進行改良。 方法體外原代培養(yǎng)SD大鼠神經(jīng)干細胞：從出生2天內(nèi)SD新生大鼠的海馬中分離和培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞,經(jīng)過傳代,取第3代神經(jīng)干細胞球,采用免疫熒光細胞化學(xué)技術(shù)鑒定神經(jīng)干細胞特異性標(biāo)志物nestin(巢蛋白)的表達；向培養(yǎng)基中添加5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)24h后,檢測BrdU在增殖神經(jīng)干細胞中的表達；神經(jīng)干細胞在有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天,通過檢測標(biāo)志物βⅢ-tubulin、GFAP分別鑒定神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。 結(jié)果體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞能增殖形成神經(jīng)干細胞球,其增殖的細胞可檢出神經(jīng)干細胞特異性標(biāo)志物nestin;培養(yǎng)的細胞能將BrdU結(jié)合到細胞核中；改用血清培基后,神經(jīng)干細胞能分化標(biāo)志物βⅢ-tubulin陽性的神經(jīng)元和GFAP陽性的星型膠質(zhì)細胞。 結(jié)論1.本實驗從SD大鼠海馬中分離和培養(yǎng)的細胞,其特異性標(biāo)志物、增殖和分化能力等方面均具備神經(jīng)干細胞的基本屬性；2.通過實驗改良了神經(jīng)干細胞的原代培養(yǎng)和鑒定方法,提高了原代培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的質(zhì)量和數(shù)量。 第二部分谷氨酸對神經(jīng)干細胞增殖作用的實驗研究 目的利用體外原代培養(yǎng)的大鼠NSCs,探討谷氨酸對NSCs增殖作用的影響,為進一步研究內(nèi)源性神經(jīng)干細胞原位激活機制提供理論依據(jù)。 方法取第3代神經(jīng)干細胞,在含有不同濃度谷氨酸的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天,采用倒置顯微鏡下細胞計數(shù)和細胞活力MTT檢測兩種方法分別檢測不同濃度谷氨酸組神經(jīng)干細胞增殖情況。 結(jié)果神經(jīng)干細胞在無血清神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中,去除神經(jīng)營養(yǎng)因子,加入不同濃度的谷氨酸繼續(xù)培養(yǎng)7天后,倒置顯微鏡下細胞計數(shù)和細胞活力MTT檢測結(jié)果共同顯示低濃度谷氨酸可促進神經(jīng)干細胞增殖。 結(jié)論1.無血清體外培養(yǎng)條件下,低濃度谷氨酸可促進神經(jīng)干細胞的增殖,谷氨酸最佳作用濃度為200μmol/L;2無血清體外培養(yǎng)條件下,高濃度谷氨酸可抑制神經(jīng)干細胞的增殖,并有一定的細胞毒性。
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【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：2494197