【摘要】：目的：應用焦磷酸測序技術(shù)對腎臟固有細胞表型轉(zhuǎn)化標志性蛋白α-SMA的基因轉(zhuǎn)錄起始點附近序列的甲基化狀態(tài)進行定位、定量檢測，分析比較腎小球系膜細胞（HBZY-1）及腎間質(zhì)成纖維細胞（NRK-49F）在表型轉(zhuǎn)化前后α-SMA基因的甲基化圖示及數(shù)量的差異，從表觀遺傳學水平闡述腎臟固有細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的可能機制，為腎臟纖維化的早期防治及尋找新的治療靶標提供新的可行性研究思路。方法：（1）分別對HBZY-1及NRK-49F進行體外培養(yǎng)，，同步化后兩株細胞均分為無血清培養(yǎng)的正常對照組和重組人TGF-β1（10ug/L，48h）誘導的誘導組各兩組。各組細胞分別進行形態(tài)學觀察、細胞爬片及培養(yǎng)上清液收集，細胞爬片進行免疫細胞化學染色觀察細胞胞漿內(nèi)α-SMA蛋白表達情況，ELISA檢測培養(yǎng)上清液中Ⅰ型膠原含量，分別比較兩株細胞各組實驗結(jié)果，判定誘導條件誘導細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的結(jié)果。（2）根據(jù)實驗前部分驗證結(jié)果，采用同等條件誘導細胞表型轉(zhuǎn)化，收集各組新鮮細胞，提取全基因組DNA，應用焦磷酸測序技術(shù)檢測α-SMA基因轉(zhuǎn)錄起始點附近甲基化狀態(tài)，比較兩株細胞各組甲基化情況。結(jié)果：（1）誘導后的兩株細胞均發(fā)生形態(tài)學改變，表現(xiàn)為細胞胞體增大，胞漿豐富，胞核增大，HBZY-1由梭形或不規(guī)則星形變?yōu)槎嘟切位驑渲π�，擴張胞突連接成片，NRK-49F由長梭形變?yōu)槎趟笮位蚨嘟切�，部分可見胞�?nèi)空泡。（2）細胞免疫化學檢測顯示，正常HBZY-1胞漿內(nèi)僅有少量α-SMA蛋白呈弱陽性表達，誘導后胞漿內(nèi)α-SMA蛋白呈強陽性高表達（P＜0.05）；正常NRK-49F胞漿內(nèi)無α-SMA蛋白表達，誘導后胞漿α-SMA蛋白出現(xiàn)并呈強陽性高表達（P＜0.05）。（3）ELISA檢測顯示，正常HBZY-1及NRK-49F的培養(yǎng)上清液中均含有Ⅰ型膠原，誘導后兩株細胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ型膠原含量均明顯增多（P＜0.05）。（4）正常HBZY-1及NRK-49F中α-SMA基因呈現(xiàn)不同程度甲基化，HBZY-1甲基化頻率在20%-50%之間呈低甲基化狀態(tài)，NRK-49F甲基化頻率＞50%呈高甲基化狀態(tài)，誘導后兩株細胞中α-SMA基因甲基化圖示及數(shù)量均無變化。結(jié)論：（1）TGF-β1可誘導HBZY-1及NRK-49F發(fā)生細胞表型轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)變?yōu)楦弑磉_α-SMA蛋白、能分泌大量細胞外基質(zhì)的肌成纖維細胞，在腎臟纖維化形成中的發(fā)揮重要作用。（2）α-SMA基因轉(zhuǎn)錄起始點附近甲基化狀態(tài)在腎臟固有細胞表型轉(zhuǎn)化中作用尚不能完全明確，是否通過表觀遺傳修飾中DNA甲基化狀態(tài)的改變促進腎臟纖維化的發(fā)展有待進一步研究。
[Abstract]:Objective: to localize and quantitatively detect the methylated status of 偽-SMA gene near the starting point of gene transcription in renal intrinsic cell phenotypic transformation marker protein by pyrophosphate sequencing. The methylation patterns and quantity of 偽-SMA gene in Mesangial cells (HBZY-1) and interstitial fibroblasts (NRK-49F) before and after phenotypic transformation were analyzed and compared. This paper expounds the possible mechanism of phenotypic transformation of renal intrinsic cells from the level of epigenetics, and provides a new feasible research idea for the early prevention and treatment of renal fibrosis and the search for new therapeutic targets. Methods: (1) HBZY-1 and NRK-49F were cultured in vitro. After synchronization, the two cells were divided into two groups: normal control group without serum culture and recombinant human TGF- 尾 1 (10 ug 鈮

本文編號：2491633