【摘要】：布魯氏菌病是一種人畜共患傳染病,主要導致家畜流產(chǎn)和人類波狀熱,該病在全世界均有分布,在部分國家廣泛流行。布魯氏菌是布魯氏菌病的病原體,能引起家畜和野生動物感染,人布魯氏菌病主要是由于接觸感染的動物而致病。此外,布魯氏菌容易氣溶膠化,是早期被用于生物戰(zhàn)劑研究的細菌。因此,布魯氏菌病是一種危害人類健康、經(jīng)濟發(fā)展和社會安全的重要傳染病。 根據(jù)宿主范圍和生化特性等的不同,布魯氏菌可分為6個經(jīng)典種19個生物型,包括羊種(1、2和3型)、牛種(1、2、3、4、5、6、7和9型)、豬種(1、2、3、4和5型)、犬種、綿羊附睪種和沙林鼠種。其中牛種、羊種和豬種為世界各地的主要致病種。牛種布魯氏菌主要感染牛,羊種布魯氏菌主要感染綿羊和山羊,而豬種布魯氏菌則有更為廣泛的宿主范圍。同時,這3個種也是引起人布魯氏菌病的主要布魯氏菌種。不同種的布魯氏菌具有不同的宿主范圍,對人或動物的毒力也存在很大的差異,有的動物帶菌不表現(xiàn)癥狀,而有的種型癥狀明顯。在我國主要流行的是羊種和牛種布魯氏菌,而其它國家和地區(qū)流行的更多的是牛種,其次是羊種。 布魯氏菌是一種在DNA水平相對保守的細菌,這與該菌的基本特性有關。布魯氏菌是一種胞內(nèi)寄生菌,與其它生物發(fā)生遺傳交換的幾率小,從而使得其基因組的動態(tài)變化小。布魯氏菌中有兩條染色體,但沒有質(zhì)粒,很多外源的質(zhì)粒也無法在細菌中復制,這也是其基因組變異小的一個原因。盡管如此,一系列的遺傳多態(tài)性的分析顯示,不同布魯氏菌株在DNA水平上仍存在較大的差異。DNA雜交、VNTR多態(tài)性分析結果顯示,不同種型的布魯氏菌及其分離株可被分為不同的基因型,提示其基因組中存在的變異。 基因組測序為細菌的研究提供了新的平臺,特別是在同種細菌有多株菌完成測序的情況下,可進行全基因組序列的比較。這種基于全基因組的比較能夠提供大量有關細菌基因組組成、致病性等的相關信息。自2001年完成第一株布魯氏菌測序以后,到目前為止,數(shù)據(jù)庫中已有10株布魯氏菌的全基因組序列。多株布魯氏菌全基因組測序的完成,為基因組的比較研究提供了可能,也為不同種型布魯氏菌基因組比較和基因組進化分析奠定了基礎。 在本研究中,我們首先從數(shù)據(jù)庫中下載10株布魯氏菌的全基因組序列,對基因組的組成進行了比較分析,通過編寫腳本,完成10株布魯氏菌全基因組序列的系統(tǒng)比較。將每株菌的基因與其它菌的基因及其基因組進行比較,得到全部基因比較的非冗余的0/1矩陣,查找出10株菌中均存在的基因和差異分布的基因,并對這些基因在兩條染色體上的分布進行了比較分析。結果顯示,來自不同種型的10株布魯氏菌無論是兩條染色體的長度、編碼基因的數(shù)量和tRNA,還是假基因的數(shù)量均存在一定差異。大部分菌株的I號染色體大小為2.1Mb,II號染色體大小為1.2Mb,而豬種布魯氏菌B.suis 23445菌株的I號染色體只有1.9Mb,缺少的區(qū)域被轉(zhuǎn)移到了II號染色體上。不同菌株中假基因的數(shù)量差別很大,最少的microti菌株只有63個,而2308菌株則多達316個,假基因的積累反映了菌株的適應性進化。根據(jù)10株菌基因組序列的比較結果,初步對布魯氏菌的全基因和共有基因進行了分析,其中全基因為4815個,共有基因為2231個,差異分布的基因占了53.7%,分析結果表明不同種型的布魯氏菌在基因水平上仍存在較大的差異。從差異基因的染色體分布看,II號染色體上差異基因密度遠遠高于I號染色體,表明絕大部分差異分布的基因位于II號染色體上,這與以往研究認為的II號染色體是布魯氏菌的一個大質(zhì)粒的觀點是一致的。 通過基因組的比較,鑒定出一些在不同菌株中分布的連續(xù)基因,這些連續(xù)的基因同時存在或缺失,將這些連續(xù)基因形成的區(qū)段稱為差異區(qū)段。通過分析,共發(fā)現(xiàn)有46個差異區(qū)段,這些差異區(qū)段所含有的基因數(shù)量從2個到41個不等。為了驗證這些差異區(qū)段在不同種型的菌株中是否存在差異分布,我們根據(jù)差異區(qū)段的組成,從每個差異區(qū)段中選取了2個基因作為代表基因,設計引物進行PCR擴增,分析各個差異區(qū)段在6個經(jīng)典種19個生物型的布魯氏菌株中的分布。經(jīng)過分析,發(fā)現(xiàn)其中42個差異區(qū)段的代表基因均能夠被檢測到同時存在或同時缺失,表明這42個是真正的差異區(qū)段。然后,對這42個差異區(qū)段的遺傳特征進行了分析,發(fā)現(xiàn)其中大部分區(qū)段的GC含量低于染色體的平均GC含量,在其中16個差異區(qū)段的周圍發(fā)現(xiàn)了重組酶和tRNA,這些遺傳特征表明這些差異區(qū)段可能是從外部獲得的。利用差異分布的差異區(qū)段,對不同種型的布魯氏菌進行了聚類分析,結果顯示,牛種和羊種布魯氏菌分別聚到了一起,但是豬種布魯氏菌不同型之間的差異很大,分別與其它種型的布魯氏菌聚在了一起。差異區(qū)段所含有基因的功能信息,以及差異區(qū)段在不同種型中的分布,反映了不同種型布魯氏菌在基因水平的多態(tài)性,可能與其不同的生化特征、毒力表型有一定關系。 布魯氏菌種的分化一直是布魯氏菌微進化研究的一個重要內(nèi)容。基于全基因組序列的進化分析顯示,綿羊附睪種布魯氏菌是一種比較古老的布魯氏菌,而牛種和羊種布魯氏菌則是分化程度較高的種。為了進一步探討布魯氏菌分化過程中基因水平的變化,我們在上述分析的基礎上,通過測定標準菌株的看家基因,構建不同種型布魯氏菌的遺傳進化樹,并在此基礎上對進化過程中基因的獲得與缺失進行分析。根據(jù)文獻調(diào)研,共選取了7個看家基因aroA、cobQ、dnaK、gap、glk、gyrB和trpE進行多態(tài)性分析。結果顯示,每個基因的等位基因數(shù)從3到7個不等,其中trpE的等位基因數(shù)最少,只有3個,glk最多,有7個。根據(jù)每個基因的等位基因型,19株不同種型的標準菌株共分為了13個ST型,其中ST2(牛5和牛9)、ST12(羊2和羊3)各含2株;ST1(牛1、牛2和牛4)、ST6(犬、豬3和豬4)各含3株。Splitree分析顯示19株布魯氏菌形成了5個不同的分支,分別為牛種、豬種/犬種、沙林鼠種、羊種和綿羊附睪種分支,eBURST克隆群分析顯示,19株布魯氏菌形成了2個克隆群CC1和CC2,其中CC1主要是牛種的不同型的菌株組成,CC2主要有豬種和犬種的菌株組成。利用看家基因的串聯(lián)序列,構建了菌株間的遺傳進化樹,從進化樹上看,綿羊附睪種單獨為一支,牛種和羊種菌聚為一支,豬種和犬種聚為一支,沙林鼠種為一支。在該進化樹的基礎上,進一步分析了差異區(qū)段的獲得與缺失。所有的牛種菌和豬種菌共同缺失了DFR24、25、36、38、39和40,除綿羊附睪種以外的其它種型的細菌均缺失了DFR38和DFR39。而與其它細菌相比,綿羊附睪中特異缺失了13個DFR(DFR3,4,12,19,20,21,22,29,31,32,34,35和41),說明不同種型的標準菌株中存在規(guī)律性、特征性缺失。另一方面,我們也發(fā)現(xiàn)了一些DFR在不同菌株中分布不同,某些DFR只在特定的菌株中缺失,有的只在部分分支中缺失,并且在距離較遠的不同分支上存在相同的缺失,說明基因的獲得與缺失是一個平行發(fā)生的過程,可能與宿主的適應性等密切相關。 通過上述研究與分析,在本研究中我們對布魯氏菌的基因組進行了系統(tǒng)的比較分析。結果表明盡管布魯氏菌的基因組相對較為保守,但仍存在很大的差異,而這種差異主要來源于布魯氏菌的II號染色體。在布魯氏菌基因組中存在一些差異區(qū)段,其中部分差異區(qū)段具有外源DNA的特征,同時這些區(qū)段在不同菌株中的分布不同,表明這些差異區(qū)段是布魯氏菌從外部獲得的。與基于看家基因的進化樹相比,部分差異區(qū)段在不同種型間存在規(guī)律性的分布,而另外一些差異區(qū)段的分布沒有隨進化關系而呈現(xiàn)獲得與缺失的規(guī)律性變化。這種分布表明,基因的獲得與缺失更可能與細菌的適應性相關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：S855.1;R378

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