【摘要】：使用全人源噬菌體單鏈抗體文庫進(jìn)行篩選,獲得特異性靶向磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)的單鏈抗體,并對單鏈抗體的生物學(xué)活性和抗原表位進(jìn)行鑒定。經(jīng)過4輪"結(jié)合-淘洗-洗脫-擴(kuò)增"后,利用噬菌體ELISA和IMGT數(shù)據(jù)庫分析抗體序列的靶向性和完整性。單鏈抗體的基因序列與表達(dá)載體p ET-22b進(jìn)行雙酶切并連接,重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli Rosetta(DE3),抗體表達(dá)后經(jīng)Ni~(2+)柱親和層析純化,通過SDS-PAGE和Western blot對單鏈抗體分子質(zhì)量進(jìn)行鑒定。抗體對抗原的親和力常數(shù)通過ELISA和SPR實(shí)驗(yàn)獲得,流式細(xì)胞術(shù)分析其與細(xì)胞膜受體的結(jié)合能力。經(jīng)篩選獲得4個單鏈抗體(1F7、1D7、1D4和1B10)具有良好的靶向性和親和力,其中1F7單鏈抗體的親和力和結(jié)合能力最高。本課題抗GPC3單鏈抗體為雙特性抗體和免疫毒素等新一類免疫治療藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:The single chain antibody targeting phosphatidylinositol 3 (GPC3) was obtained by screening the whole human bacteriophage single chain antibody library, and the biological activity and antigenic epitope of the single chain antibody were identified. After four rounds of "binding-eluting-amplification", the targeting and integrity of antibody sequences were analyzed by bacteriophage ELISA and IMGT database. The gene sequence of single chain antibody was digested and ligated with the expression vector p ET-22b, and the recombinant vector was transformed into E. coli E.coli Rosetta (DE3). The antibody was expressed and purified by Ni~ (2) column affinity chromatography. The molecular weight of single chain antibody was identified by SDS-PAGE and Western blot. The affinity constant of antibody to antigen was obtained by ELISA and SPR assay. The binding ability of antibody to cell membrane receptor was analyzed by flow cytometry. Four single chain antibodies (1F7, 1D7, 1D4 and 1B10) were obtained with good targeting and affinity, among which 1F7 single chain antibodies had the highest affinity and binding ability. In this study, anti-GPC3 single chain antibody laid a foundation for the development of new immunotherapeutic drugs such as bicharacteristic antibodies and immunotoxins.
【作者單位】： 中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院;
【基金】：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目資助(81473125) 江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20161459) 西比曼生物科技(上海)有限公司項(xiàng)目資助
【分類號】：R392-33

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本文編號：2481221