【摘要】：近年來(lái),隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展,環(huán)境污染問(wèn)題也日益突出。環(huán)境污染嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的身體健康,而且已成為21世紀(jì)社會(huì)發(fā)展所面臨的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。環(huán)境污染主要包括大氣污染、水體污染和土壤污染,其中對(duì)人類(lèi)健康影響最直接和最嚴(yán)重的是空氣污染�？諝馕廴疚镏饕ㄒ詥我换瘜W(xué)物質(zhì)形式存在的烴類(lèi)和甲醛等氣態(tài)污染物和以復(fù)合物形式存在的總懸浮顆粒物等大氣顆粒污染物�？諝馕廴疚镏饕ㄟ^(guò)呼吸道等途徑進(jìn)入機(jī)體,與人類(lèi)的呼吸和心血管等系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關(guān)。在環(huán)境污染物對(duì)人類(lèi)健康效應(yīng)的研究中,毒性評(píng)估是最常用和最有效的手段之一。目前常用的測(cè)定細(xì)胞存活率、氧化損傷和遺傳損傷等細(xì)胞損傷水平的毒性評(píng)估實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜,且僅能分析環(huán)境污染物對(duì)細(xì)胞或生物體的某一類(lèi)毒性效應(yīng)。因此,亟須建立一種操作簡(jiǎn)便、成本較低的毒性評(píng)估方法來(lái)綜合評(píng)價(jià)空氣中的單一和復(fù)合化學(xué)污染物的各種毒性。近年來(lái),基于細(xì)胞應(yīng)激基因啟動(dòng)子調(diào)控的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)已成為最具有潛力的毒性評(píng)估方法之一。 熱休克反應(yīng)(Heat Shock Response, HSR)是以熱休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)的誘導(dǎo)合成為主要特征的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。在眾多的HSPs家族中,最為重要的是由HSPA1A基因編碼HSPA1A(Hsp70-1)蛋白。HSPA1A通常參與蛋白質(zhì)的合成和折疊,錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的正確折疊和降解。當(dāng)細(xì)胞受到各種應(yīng)激因素,如高溫、重金屬和化學(xué)毒物等作用后,胞質(zhì)中的熱休克因子Heat Shock Factor, HSF)被激活并進(jìn)入細(xì)胞核與位于HSPA1A啟動(dòng)子區(qū)域的熱休克元件(heat shock element, HSE)結(jié)合,激活HSPA1A基因的轉(zhuǎn)錄,啟動(dòng)HSPA1A蛋白的表達(dá)。由于該基因?qū)Ω鞣N環(huán)境應(yīng)激因素十分敏感,HSPA1A基因的表達(dá)逐漸成為環(huán)境污染物對(duì)細(xì)胞或生物體早期毒性效應(yīng)的一種敏感的標(biāo)志物。目前,基于HSPA1A基因啟動(dòng)子調(diào)控的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)已成為常用的環(huán)境污染物毒性評(píng)估方法之一。盡管有研究者選用了HSPA1A啟動(dòng)子調(diào)控的熒光素酶報(bào)告基因細(xì)胞體系來(lái)評(píng)估重金屬、有機(jī)氯化合物、城市廢水等水體和土壤污染物的毒性,但是,利用HSPA1A啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)來(lái)評(píng)估多環(huán)芳烴、甲醛、汽車(chē)尾氣和焦?fàn)t逸散物等單一和復(fù)合空氣污染物的毒性的研究鮮有報(bào)道。 基于上述研究,本研究擬構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSPA1A啟動(dòng)子調(diào)控的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞體系(HepG2/HSAPA1A細(xì)胞),并用該細(xì)胞來(lái)綜合評(píng)價(jià)空氣中常見(jiàn)的單一和復(fù)合化學(xué)污染物的毒性。芘、苯并[a]芘、甲醛、汽車(chē)尾氣和焦?fàn)t逸散物等環(huán)境污染物作用HepG2/HSAPA1A細(xì)胞后,分別測(cè)定細(xì)胞的熒光素酶活性、存活率、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的丙二醛(MDA)濃度、細(xì)胞的DNA損傷水平和微核率,并將HepG2HSPA1A細(xì)胞體系與細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)、MDA實(shí)驗(yàn)、單細(xì)胞凝膠電泳和微核實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行比較來(lái)評(píng)價(jià)HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系在化學(xué)污染物的綜合毒性評(píng)估中的應(yīng)用和該細(xì)胞體系的敏感性。本研究的假設(shè)是HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系的熒光素酶活性可以敏感地反映環(huán)境污染物對(duì)細(xì)胞的綜合毒性效應(yīng)。本研究共分為三部分： 第一部分HSPA1A啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因HepG2細(xì)胞體系(HepG1/HSPA1A細(xì)胞)的建立 本研究運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)來(lái)構(gòu)建HSPA1A啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因HepG2細(xì)胞體系(HepG2/HSAPA1A細(xì)胞)。首先,我們構(gòu)建了pGL4.17/HSPA1A重組質(zhì)粒,然后將經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞中,并用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2/HSPA1A細(xì)胞。最后,我們對(duì)HepG2/HSAPA1A細(xì)胞體系進(jìn)行鑒定。分別用Western blotting實(shí)驗(yàn)和Luciferase assay system試劑盒測(cè)定42℃熱休克1h后37℃恢復(fù)不同時(shí)間的HepG2/HSAPA1A細(xì)胞的HSPA1A的表達(dá)水平和熒光素酶活性。Western blotting結(jié)果顯示,與未熱休克對(duì)照組相比,熱休克后HepG2/HSPA1A細(xì)胞的HSPA1A的表達(dá)水平升高,且在恢復(fù)培養(yǎng)4h后達(dá)到峰值,隨后下降。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示,恢復(fù)培養(yǎng)4h后HSPA1A的表達(dá)水平是對(duì)照組的3倍。與對(duì)照組相比,熱休克后細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性均顯著增加(P0.01),且與HSPA1A的表達(dá)水平呈相似的變化趨勢(shì)。熱休克恢復(fù)培養(yǎng)4h后細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性達(dá)到峰值,為對(duì)照組的9倍。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示HSPA1A的表達(dá)水平與細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性呈顯著正相關(guān)。熱休克是經(jīng)典的引起熱休克反應(yīng)的應(yīng)激條件。熱休克后,HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系的HSPA1A的表達(dá)水平明顯升高,HSPA1A基因的啟動(dòng)子也增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄,這些研究結(jié)果表明HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系已構(gòu)建成功,且該細(xì)胞體系可以用于敏感地評(píng)估環(huán)境應(yīng)激因素對(duì)細(xì)胞的早期毒性效應(yīng)。 第二部分HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系在評(píng)價(jià)空氣中單一化學(xué)污染物毒性中的應(yīng)用 為了研究HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系在空氣中單一化學(xué)污染物毒性評(píng)估中的應(yīng)用,我們用空氣中常見(jiàn)的三種單一化學(xué)污染物(非致癌性多環(huán)芳烴芘、致癌性多環(huán)芳烴苯并[a]芘和致突變劑甲醛)作用HepG2/HSPA1A細(xì)胞24h后,分別測(cè)定細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性、細(xì)胞存活率、氧化損傷水平(MDA濃度)和遺傳損傷水平(Olive TM值和微核率)。研究結(jié)果顯示,芘染毒后,HepG2/HSPA1A細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性隨著染毒劑量的增加而逐漸增加,與對(duì)照相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在最高染毒劑量下(100μM),細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性為對(duì)照組的2.4倍。不同濃度的苯并[a]芘染毒HepG2/HSPA1A細(xì)胞后,細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性均顯著增加。在染毒20μM時(shí),細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性是對(duì)照組的2.7倍。較低劑量的甲醛(1μM)也能顯著增加細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性,且在最高染毒劑量(40μM)下,細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性為對(duì)照組的1.6倍。芘染毒后,細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性僅與MDA濃度呈顯著正相關(guān)(P0.01)。苯并[a]芘和甲醛染毒后,細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性與Olive TM值及細(xì)胞微核率均呈顯著正相關(guān)(P0.01)。引起細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性顯著增加所需的芘、苯并[a]芘和甲醛的劑量是等于或低于細(xì)胞存活率顯著降低、MDA濃度顯著增加、細(xì)胞Olive TM值和微核率顯著增加所需的最低劑量。這些研究結(jié)果表明Hep2/HSPA1A細(xì)胞的熒光素酶活性不僅可以作為單一化學(xué)污染物所誘導(dǎo)的細(xì)胞早期損傷的一個(gè)敏感的指標(biāo),而且可以綜合反映單一化學(xué)污染物所誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷和遺傳損傷等毒性效應(yīng)。HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系可以用于評(píng)估空氣中單一化學(xué)污染物的綜合毒性。 第三部分HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系在評(píng)價(jià)空氣中復(fù)合化學(xué)污染物毒性中的應(yīng)用 在研究了HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系在單一化學(xué)污染物毒性評(píng)估中的應(yīng)用之后,本部分將進(jìn)一步探討該細(xì)胞體系是否可以用于評(píng)估空氣中的復(fù)合化學(xué)污染物的毒性。汽車(chē)尾氣是人類(lèi)生活環(huán)境中的污染物的一個(gè)重要來(lái)源,大多數(shù)個(gè)體每天都會(huì)暴露于一定量的汽車(chē)尾氣。焦?fàn)t逸散物是燃煤型污染物的代表,其中含有大量的致癌性有毒物質(zhì),嚴(yán)重威脅著作業(yè)工人的身體健康。故本部分我們選擇在交通擁擠的街道及焦化廠工人不同作業(yè)區(qū)分別采集空氣樣本,并研究這些空氣樣本對(duì)HepG2/HSPA1A細(xì)胞的各種毒性效應(yīng)。結(jié)果顯示,不同濃度的汽車(chē)尾氣作用細(xì)胞后,細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性均顯著增加。且在0.6ng/l的劑量作用下,細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性是對(duì)照組的1.4倍。在最低染毒劑量(6pg/l)作用下,細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性與對(duì)照組相比,差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。爐底焦?fàn)t逸散物染毒細(xì)胞組的相對(duì)熒光素酶活性顯著增加,與對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。且在0.15μg/l的劑量作用下,細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性最高,為對(duì)照組的1.4倍。細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性隨著爐側(cè)和爐頂焦?fàn)t逸散物濃度的增加而逐漸增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。在爐側(cè)和爐頂焦?fàn)t逸散物染毒最高濃度時(shí)(65.4μg/l,202μg/l),細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性分別為對(duì)照組的2.1和5.3倍。汽車(chē)尾氣樣本作用后,細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性與Olive TM值及細(xì)胞微核率均呈顯著正相關(guān)(P0.01)。爐底焦?fàn)t逸散物作用后細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性與MDA濃度呈顯著正相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.404,P0.05)。爐底、爐側(cè)和爐頂焦?fàn)t逸散物染毒后,HepG2/HSPA1A細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性均與Olive TM值、細(xì)胞微核率呈顯著正相關(guān)(P0.05)。在低劑量的汽車(chē)尾氣(0.006ng/l)和焦?fàn)t逸散物(0.006μg/l)作用下,細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性已顯著增加,該劑量是等于或低于細(xì)胞存活率顯著降低、MDA濃度顯著增加、細(xì)胞Olive TM值和微核率顯著增加所需的最低劑量。這些研究結(jié)果表明,HepG2/HSPA1A細(xì)胞的熒光素酶活性可以敏感地反映汽車(chē)尾氣和焦?fàn)t逸散物對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)。熱休克反應(yīng)是非特異性的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng),RepG2/HSPA1A細(xì)胞的熒光素酶活性能夠綜合反映復(fù)合化學(xué)污染物對(duì)細(xì)胞的早期損傷。故HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系可以用于評(píng)估環(huán)境復(fù)合污染物的綜合毒性。 綜上所述,本課題的主要研究結(jié)果如下：(1)三種單一化學(xué)污染物(芘、苯并[a]芘和甲醛)和兩種復(fù)合化學(xué)污染物(汽車(chē)尾氣和焦?fàn)t逸散物)作用后,HepG2/HSPA1A細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性均顯著增加,非致癌的芘和較低濃度的汽車(chē)尾氣(pg/l)也能顯著增加細(xì)胞的熒光素酶活性；(2)在很低的劑量作用下(pg/l)我們即可觀察到細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性顯著增加,這些劑量是等于或小于細(xì)胞存活率顯著降低,細(xì)胞氧化損傷和遺傳損傷水平顯著增加所需的最低劑量,HepG2/HSPA1A細(xì)胞的熒光素酶活性可以作為環(huán)境污染物對(duì)細(xì)胞早期損傷的一個(gè)敏感指標(biāo)；(3)所有的待測(cè)定的環(huán)境污染物作用后,HepG2/HSPA1A細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性與細(xì)胞的氧化損傷和遺傳損傷水平(MAD濃度、Olive TM值和微核率)之間呈顯著正相關(guān),HepG2/HSPA1A細(xì)胞的熒光素酶活性可以綜合反映環(huán)境化學(xué)污染物所誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷和遺傳損傷等毒性效應(yīng)；(4)與檢測(cè)細(xì)胞存活率、氧化損傷和遺傳損傷水平的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)相比,用HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系來(lái)檢測(cè)環(huán)境污染物的毒性更加敏感；(5)熱休克反應(yīng)是非特異性的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng),與評(píng)價(jià)細(xì)胞的某些特定毒性終點(diǎn)效應(yīng)的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)相比,HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系可以用于評(píng)估單一和復(fù)合化學(xué)污染物的綜合毒性。 本課題的創(chuàng)新之處在于：(1)選用了具有Ⅰ相和Ⅱ相反應(yīng)所需的各種代謝酶活性的HepG2細(xì)胞來(lái)構(gòu)建毒性評(píng)估體系；(2)選用空氣中很常見(jiàn)的三種單一化學(xué)污染物(芘、苯并[a]芘和甲醛)和兩種復(fù)合污染物(汽車(chē)尾氣和焦?fàn)t逸散物)來(lái)證實(shí)HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系在環(huán)境污染物毒性評(píng)估中的應(yīng)用；(3)將HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系與其他的測(cè)定細(xì)胞存活率、氧化損傷和遺傳損傷水平的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析以證實(shí)HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系在環(huán)境污染物對(duì)細(xì)胞的綜合毒性評(píng)估中的應(yīng)用和該細(xì)胞體系的敏感性。 本研究有待進(jìn)一步研究之處有：(1)有待進(jìn)一步研究HepG2/HSPAlA細(xì)胞體系在空氣中其他的單一和復(fù)合化學(xué)污染物的毒性評(píng)估中的應(yīng)用；(2)有待進(jìn)一步將HSPA1A啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)與其他的細(xì)胞毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較以充分證實(shí)HepG2/HSPA1A細(xì)胞體系是否可以用于評(píng)估環(huán)境污染物的綜合毒性；(3)有待進(jìn)一步構(gòu)建活體毒性評(píng)估體系(如轉(zhuǎn)基因鼠)來(lái)更真實(shí)的反映環(huán)境污染物的毒性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 高良輝 ,鄒偉榮;熱休克蛋白的生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).外科學(xué)分冊(cè);2001年06期

2 Asad Naeem Shah;;Effects of continuously regenerating diesel particulate filters on regulated emissions and number-size distribution of particles emitted from a diesel engine[J];Journal of Environmental Sciences;2011年05期

3 宮智勇;牛丕業(yè);王峰;袁晶;鄒云峰;楊瑾;鄔堂春;;HSP70在苯并(a)芘致細(xì)胞DNA損傷中的保護(hù)作用[J];環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué);2007年02期

4 薛麗香,童坦君,張宗玉;報(bào)告基因的選擇及其研究趨向[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2002年04期

5 韓世偉;張忠濤;王宇;;構(gòu)建人熱休克蛋白70基因重組腺病毒載體及鑒定[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2010年37期

，

本文編號(hào)：2480475