【摘要】：背景和目的 抑郁的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,關(guān)于抑郁的病因也有很多種理論假說,其中海馬神經(jīng)元的損傷和再生障礙在抑郁的發(fā)病過程中越來越受重視。海馬是大腦中神經(jīng)元可再生的重要區(qū)域之一,海馬中的神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells, NSCs)是神經(jīng)元的前體細(xì)胞,對(duì)于神經(jīng)元的數(shù)量再生與維持有重要影響。體外實(shí)驗(yàn)表明炎性細(xì)胞因子白介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)能抑制海馬神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖,因此,研究IL-1β在抑郁癥發(fā)病過程中的作用和機(jī)制,不僅有利于揭示抑郁癥的發(fā)病機(jī)制,也將為開發(fā)新型抗抑郁藥物提供新的靶點(diǎn)。 本課題組前期的研究成果證明:腹腔注射脂多糖、腹腔注射利血平均可引起大鼠的行為性抑郁,同時(shí)腦內(nèi)不同區(qū)域的細(xì)胞因子IL-1β的升高,腦內(nèi)注射IL-1β受體拮抗劑可以部分改善這種行為性抑郁,給予腺苷受體拮抗劑咖啡因和A2A受體拮抗劑可以部分逆轉(zhuǎn)這種行為性抑郁;腦室內(nèi)注射IL-1β可以誘導(dǎo)大鼠的行為性抑郁;體外IL-1β能劑量依賴性的抑制海馬神經(jīng)元的活性,降低BDNF表達(dá),CREB-BDNF通路可能在其中有著至關(guān)重要的作用,NMDAR可能參與其中。上述研究表明IL-1β與行為性抑郁有著密切的關(guān)系,關(guān)于其分子生物學(xué)機(jī)制可能與抑制腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子BDNF)的表達(dá)降低有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步探究IL-1β對(duì)于神經(jīng)元的前體細(xì)胞-神經(jīng)干細(xì)胞活性的影響及其機(jī)制,并研究A_(2A)受體及NMDA受體在其中的作用,以及IL-1β對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響。 材料和方法 1.海馬神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定 24h內(nèi)SD大鼠新生鼠3-4只,斷頭取腦,分離兩側(cè)海馬,機(jī)械吹打成為單細(xì)胞懸液,加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液,置入37℃、5%CO_2培養(yǎng)箱30min,去除為成纖維細(xì)胞,24h后棄掉上清液,重新加入含10%FBS的DMEM/F12新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)72h,離心棄掉上清液,換用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液(含2% B27、20ng/ml bFGF及20ng/ml EGF的DMEM/F12培養(yǎng)液),3-4天換液,7-8天傳代一次。連續(xù)純化培養(yǎng)約21天,以作實(shí)驗(yàn)用材。神經(jīng)干細(xì)胞高度選擇性單克隆抗體Nestin (巢蛋白)行免疫細(xì)胞化學(xué)immunocytochemistry, ICC)鑒定。 2. IL-1β對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制 以IL-1β孵育神經(jīng)干細(xì)胞3天換液并取出一半細(xì)胞,測(cè)細(xì)胞活性。剩余細(xì)胞再補(bǔ)足新鮮培養(yǎng)液及藥物繼續(xù)孵育3天取出全部的細(xì)胞,MTT法測(cè)細(xì)胞活性。 以不同濃度的IL-1β孵育神經(jīng)干細(xì)胞3天,收集上清液以ELISA試劑盒測(cè)其上清液中的BDNF濃度。 以10ng/ml IL-1β孵育神經(jīng)干細(xì)胞,同時(shí)加入NMDA受體拮抗劑MK-801或者A_(2A)受體拮抗劑MSX-3,共同孵育3天,取出全部的細(xì)胞,MTT法測(cè)細(xì)胞活性。 3.咖啡因及NGF對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響 以咖啡因,NGF孵育神經(jīng)干細(xì)胞3天,換液并取出一半細(xì)胞,測(cè)細(xì)胞活性。剩余細(xì)胞再補(bǔ)足新鮮培養(yǎng)液及藥物,繼續(xù)孵育3天取出全部的細(xì)胞,MTT法測(cè)細(xì)胞活性。 4. IL-1β對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的影響 多聚賴氨酸鋪板,調(diào)整神經(jīng)干細(xì)胞的密度,10%FBS+正常神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液加入不同實(shí)驗(yàn)濃度IL-1β(0、5、10、20)ng/ml分化3天,換液繼續(xù)分化培養(yǎng),共6天,去除上清液,分別用GFAP和β-TubulinⅢ行熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色計(jì)數(shù)以及用流式細(xì)胞儀檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的比例。 5.統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用Excel 2003和SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x|-)±SD)表示,采用方差分析進(jìn)行比較,以P=0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P=0.01為差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 第一部分IL-1β對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞活性的影響及其機(jī)制 1.神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、鑒定 機(jī)械吹打后神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液初始為單細(xì)胞懸液,24h后見到上清液中漂浮有大量組織殘塊,難于觀察神經(jīng)球,棄去大部分上清液,補(bǔ)充新鮮的含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液,24h后視野中即出現(xiàn)約4-8個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的克隆球,細(xì)胞持續(xù)分裂增殖,第四天時(shí)換液,換用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液,此時(shí)細(xì)胞克隆球的直徑約為50um-100um。第七天時(shí),細(xì)胞形成的克隆球直徑約為100-200um。胰酶消化3-5min,用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液等體積終止消化,PBS沖洗細(xì)胞兩遍,玻璃吸管機(jī)械吹打成單細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán),加入新鮮的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液,細(xì)胞會(huì)按照同樣的規(guī)律再次分裂增殖形成克隆球。大約21天后第三代神經(jīng)干細(xì)胞可作為試驗(yàn)用材。 多聚賴氨酸鋪培養(yǎng)板,去離子水沖洗2次,神經(jīng)干細(xì)胞貼壁24小時(shí)后,用巢蛋白(Nestin)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,可見到克隆球整體著色,視野中所有細(xì)胞球全部成陽性反應(yīng)。 2. IL-1β降低神經(jīng)干細(xì)胞活性 IL-1β(0、5、10、20)ng/ml孵育海馬神經(jīng)干細(xì)胞,孵育3天取出一半細(xì)胞MTT法測(cè)細(xì)胞活性,剩余的細(xì)胞補(bǔ)足新鮮培養(yǎng)液,IL-1β加至原實(shí)驗(yàn)濃度繼續(xù)培養(yǎng)3天,取出剩余的全部細(xì)胞,以同樣的方法測(cè)細(xì)胞活性。 結(jié)果顯示:以濃度(0、5、10、20)ng/ml的IL-1β孵育海馬神經(jīng)干細(xì)胞,孵育3天檢測(cè)細(xì)胞活性的OD值分別為(0.511±0.054,0.425±0.053,0.394±0.033和0.380±0.052),與0ng/ml組相比較,(5、10、20)ng/ml的IL-1β能降低神經(jīng)干細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為P0.05,P0.01,P0.01,ANOVA);孵育6天檢測(cè)細(xì)胞活性的OD值分別為0.453±0.075,0.366±0.072,0.339±0.038和0.330±0.059),與0ng/ml組相比較, (5、10、20)ng/ml組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為P0.05,P0.01, P0.01,ANOVA)。 結(jié)果表明,以不同濃度的IL-1β孵育海馬神經(jīng)干細(xì)胞3天或6天,均可劑量依賴性的降低海馬神經(jīng)干細(xì)胞的活性。 3. NMDA受體拮抗劑反轉(zhuǎn)IL-1β對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞活性的抑制作用 選擇10ng/ml濃度的IL-1β孵育海馬神經(jīng)干細(xì)胞3天,同時(shí)加入不同濃度的NMDA受體拮抗劑MK-801(0,2.5,5,10,20,40)um/ml,同時(shí)設(shè)無IL-1β和MK-801的對(duì)照組,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。 結(jié)果表明:與對(duì)照組OD值(0.486±0.078)相比,IL-1β10ng/ml(0.343±0.054)可降低神經(jīng)干細(xì)胞活性,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);不同濃度(0,2.5,5,10,20,40)um/ml的MK-801與IL-1β(10ng/ml)共同孵育干細(xì)胞,其活性檢測(cè)的OD值分別是(0.343±0.054,0.411±0.035,0.443±0.117,0.543±0.089,0.511±0.038和0.509±0.028)。當(dāng)MK-801濃度為(5,10,20,40)um/ml時(shí),可反轉(zhuǎn)IL-1β對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的活性抑制作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01, P0.01, P0.01,ANOVA)。 4. A_(2A)受體拮抗劑對(duì)IL-1β抑制干細(xì)胞活性作用的影響 選擇10ng/ml濃度的IL-1β孵育海馬神經(jīng)干細(xì)胞3天,同時(shí)加入不同濃度的腺苷A_(2A)受體拮抗劑MSX-3(0,125,250,500,1000, 2000)ng/ml,同時(shí)設(shè)無IL-1β和MSX-3的對(duì)照組,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。 與對(duì)照組OD值(0.612±0.213)相比,IL-1β10ng/ml、MSX-3(0ng/ml)組(0.397±0.047)神經(jīng)干細(xì)胞活性顯著降低,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);不同濃度的腺苷A_(2A)受體拮抗劑MSX-3(0,125,250,500,1000, 2000ng/ml)與IL-1β10ng/ml共同孵育干細(xì)胞,其活性檢測(cè)的OD值分別是:(0.397±0.047,0.453±0.020,0.476±0.068,0.557±0.049,0.456±0.064和0.435±0.129)。結(jié)果表明,當(dāng)A_(2A)受體拮抗劑MSX-3濃度為500ng/ml時(shí)可反轉(zhuǎn)IL-1β對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的活性抑制作用(P0.05) ,其它濃度的MSX-3均無顯著性作用(P0.05,ANOVA)。 5. IL-1β抑制海馬神經(jīng)干細(xì)胞釋放BDNF 以IL-1β(0、5、10、20)ng/ml孵育海馬神經(jīng)干細(xì)胞3天,Elisa試劑盒法檢測(cè)上清液中的BDNF濃度,結(jié)果顯示:與對(duì)照0ng/ml組(14.179±2.021)pg/ml相比較,各加藥組上清液中BDNF的濃度分別為(10.346±1.377)pg/ml, (9.013±1.250)pg/ml, (2.429±0.382)pg/ml,含量顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01, P0.01,ANOVA)。 第二部分IL-1β對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響 1. IL-1β對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響 經(jīng)胰酶消化和機(jī)械吹打,將神經(jīng)干細(xì)胞球制成單細(xì)胞懸液,以含10%FBS的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。以5×104/ml的細(xì)胞濃度鋪96孔板分化,用免疫細(xì)胞化學(xué)染色;以50×104/ml的細(xì)胞濃度培養(yǎng)細(xì)胞鋪12孔板分化,用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。培養(yǎng)體系中分別加入不同濃度的IL-1β(0、5、10、20)ng/ml,分化6天后以兔抗大鼠GFAP進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色和流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例。 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果表明IL-1β10ng/ml(83.207%±0.008)與IL-1β0ng/ml(77.620%±0.029)相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),IL-1β20ng/ml (88.096%±0.020)與IL-1β0ng/ml相比較,差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01), IL-1β5ng/ml(79.989%±0.048)與IL-1β0ng/ml組相比較,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。IL-1β各劑量組間比較,除IL-1β20ng/ml(88.096%±0.020)與IL-1β10ng/ml(83.207%±0.008)組相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余組間差異無顯著性(P0.05)。結(jié)果表明:IL-1β可以劑量依賴性的提高神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的比例。 流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果大體一致:與對(duì)照組IL-1β0ng/ml組(78.550%±0.018)相比較,IL-1β10 ng/ml組(82.447%±0.005)與IL-1β20 ng/ml組(84.847%±0.012)差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01, P0.01),IL-1β5 ng/ml組(78.863%±0.005)與對(duì)照組IL-1β0 ng/ml組(78.550%±0.018)相比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-1β10 ng/ml組(82.447%±0.005)及IL-1β20 ng/ml組(84.847%±0.012)與IL-1β5 ng/ml組(78.863%±0.005)相比較差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01, P0.01),IL-1β20 ng/ml組(84.847%±0.012)與IL-1β10 ng/ml組(82.447%±0.005)相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2. IL-1β對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元的影響 經(jīng)胰酶消化和機(jī)械吹打,將神經(jīng)干細(xì)胞球制成單細(xì)胞懸液,以含10%FBS的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。以5×10~4/ml的細(xì)胞濃度鋪96孔板分化,分別加入不同濃度的IL-1β(0、5、10、20)ng/ml,培養(yǎng)6天后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,以β-TubulinⅢ標(biāo)記神經(jīng)元,計(jì)數(shù)神經(jīng)元的比例。 結(jié)果顯示:與對(duì)照組IL-1β0 ng/ml(11.486%±0.032)組相比較,IL-1β(5、10、20)ng/ml組神經(jīng)元的比例為(9.202%±0.025,9.922%±0.025,9.564%±0.014),差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明,IL-1β對(duì)體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元沒有直接的作用。 第三部分咖啡因與NGF對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響 1.咖啡因?qū)w外神經(jīng)干細(xì)胞活性的影響 本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:腺苷受體拮抗劑咖啡因和A_(2A)受體拮抗劑可以部分逆轉(zhuǎn)IL-1β所致的行為性抑郁,說明咖啡因?qū)τ贗L-1β的影響有一定的反轉(zhuǎn)作用,但體外實(shí)驗(yàn)證明咖啡因直接對(duì)于神經(jīng)元的活性造成抑制作用,未能反轉(zhuǎn)IL-1β對(duì)于海馬神經(jīng)元的損傷。為進(jìn)一步明確咖啡因?qū)τ隗w外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖的影響及咖啡因作為腺苷受體阻斷劑是否參與IL-1β介導(dǎo)的神經(jīng)損傷作用。 咖啡因(0,0.1,1,10)mM/ml孵育神經(jīng)干細(xì)胞3天取出一半細(xì)胞MTT法測(cè)活性,剩余細(xì)胞如上所述補(bǔ)足新鮮培養(yǎng)液及咖啡因繼續(xù)培養(yǎng),孵育6天后取出剩余全部細(xì)胞,同樣的方法測(cè)活性。 結(jié)果顯示:孵育3天,咖啡因0.1mM/ml組OD值為(0.173±0.034)與0mM/ml組(0.211±0.039)相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);咖啡因(1,10)mM/ml組OD值分別為(0.163±0.033,0.142±0.026)與0mM/ml組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01,ANOVA)。 孵育6天咖啡因濃度為0.1mM/ml的OD值為(0.167±0.023)與0mM/ml組(0.189±0.031)相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);咖啡因濃度為(1,10)mM/ml組OD值為(0.156±0.022,0.129±0.023)與0mM/ml組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01,ANOVA)。 結(jié)果提示:咖啡因可劑量依賴性地降低體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞的活性。 2. NGF對(duì)體外神經(jīng)干細(xì)胞活性的影響 NGF和BDNF同屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛存在。對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)維持正常發(fā)育和功能非常重要。要使神經(jīng)干細(xì)胞要進(jìn)行分化獲得盡可能多的神經(jīng)元,必須有足夠的神經(jīng)干細(xì)胞儲(chǔ)備。模擬體內(nèi)環(huán)境,檢測(cè)NGF能否促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。 NGF(0,20,50)ng/ml孵育神經(jīng)干細(xì)胞,孵育3天取出一半細(xì)胞MTT法測(cè)活性,補(bǔ)足新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。孵育6天取出剩余全部細(xì)胞,同樣的方法測(cè)活性。 結(jié)果表明:孵育3天NGF 20ng/ml組OD值(0.204±0.055)與0ng/ml組(0.162±0.030)相比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);NGF50ng/ml組OD值(0.240±0.068)與0ng/ml相比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,ANOVA)。 孵育6天時(shí)NGF 20ng/ml組OD值(0.163±0.037)與0ng/ml組(0.142±0.041)相比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);NGF50ng/ml組OD值(0.183±0.045)與0ng/ml組相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,ANOVA)。 結(jié)果提示:NGF能促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖活性。 結(jié)論 1. IL-1β降低體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖活性,其機(jī)制可能與BDNF含量釋放減少有關(guān),NMDA系統(tǒng)和腺苷系統(tǒng)可能參與其中。 2. IL-1β促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞方向分化,但對(duì)神經(jīng)元的分化沒有影響。 3.咖啡因體外能抑制海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖活性,NGF能促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖活性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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7 李苒;王順和;;Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化[J];醫(yī)學(xué)綜述;2008年02期

8 陳霞平;杜士明;王啟斌;張澈;張蓬華;朱小虎;;腺苷促進(jìn)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用研究[J];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2008年08期

9 Thomas R MINOR;Brain IL-1β was involved in reserpine-induced behavioral depression in rats[J];Acta Pharmacologica Sinica;2004年03期

10 王光輝;王順和;楊慧敏;李蘇;李苒;譚曉姝;;大鼠NSCs向多巴胺能神經(jīng)元分化研究[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2006年06期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前6條

1 唐少鋒;胎鼠和人胚神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2003年

2 王珍琦;抗抑郁藥的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制的研究[D];吉林大學(xué);2004年

3 孫劍瑞;神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響[D];鄭州大學(xué);2005年

4 黎海燕;新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2007年

5 王廣雷;葉酸對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞Notch和MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因及蛋白表達(dá)作用的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2008年

6 李欣;IL-1β對(duì)體外海馬神經(jīng)元的影響[D];汕頭大學(xué);2010年

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本文編號(hào)：2476914