【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis,TB)在全球范圍內(nèi)廣泛地引起人和動(dòng)物發(fā)病甚至死亡,引發(fā)重大的經(jīng)濟(jì)損失。早期準(zhǔn)確診斷和對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核病人的及時(shí)治療,減少結(jié)核發(fā)病率及降低死亡率非常重要。在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染者中,超過(guò)95%表現(xiàn)為潛伏性結(jié)核感染(latent tuberculosis infection, LTBI),若在HIV感染或自身免疫性疾病致使機(jī)體免疫力低下情況下,LTBI日后可發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核,成為主要的傳染源,因此TB感染及時(shí)檢測(cè)對(duì)于控制結(jié)核病至關(guān)重要。目前應(yīng)用最為廣泛的診斷方法是結(jié)核菌素試驗(yàn)(tuberculin skin test,TST),該診斷方法是一種以純化蛋白衍生物(PPD)或舊結(jié)核菌素(OT)為抗原進(jìn)行皮下注射的診斷方法,其特異性較差,診斷結(jié)果假陽(yáng)性率較高。因此迫切需要研究開(kāi)發(fā)出特異性好、便于臨床應(yīng)用的鑒定方法。近年來(lái)引人注目的是對(duì)于結(jié)核分枝桿菌特異性抗原診斷價(jià)值的研究進(jìn)展,因?yàn)楸容^基因組學(xué)提供了大量特異性抗原信息,并發(fā)現(xiàn)了16個(gè)MTB特異性差異區(qū)域(RD)。因此本研究選取RD2區(qū)域中的5種蛋白進(jìn)行原核融合表達(dá)與純化,對(duì)它們免疫特性進(jìn)行了初步分析,并對(duì)其牛結(jié)核血清學(xué)診斷價(jià)值進(jìn)行比較研究。 1.結(jié)核分枝桿菌RD2區(qū)五種抗原蛋白的原核表達(dá)、純化和鑒定 選取MTB RD2區(qū)5種蛋白R(shí)v1981、Rv1983、Rv1985、Rv1986和Rv1988作為研究對(duì)象,利用PCR擴(kuò)增了相應(yīng)的編碼基因,經(jīng)克隆篩選和測(cè)序鑒定正確后,利用pEASY-E1、 pET-30a(+)及pET-32a(+)質(zhì)粒構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒。鑒定正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)原核表達(dá)菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE結(jié)果顯示誘導(dǎo)后各目的蛋白均得到成功表達(dá),對(duì)可溶形式表達(dá)的融合蛋白直接進(jìn)行鎳柱親和層析純化,對(duì)以包涵體形式表達(dá)的融合蛋白在進(jìn)行變復(fù)性后進(jìn)行鎳柱親和層析純化。Western-blotting結(jié)果表明,在使用抗His單抗及兔抗TB多抗血清反應(yīng)后都出現(xiàn)了特異性目的條帶,表明融合蛋白具有較高的免疫反應(yīng)性。同時(shí),對(duì)這幾種分子的深入研究提供了條件。 2.融合蛋白免疫原性分析及其牛結(jié)核診斷價(jià)值評(píng)價(jià) 取Rv1981、Rv1983、Rv1985、Rv1986四種融合蛋白分別皮下免疫C57BL/6小鼠,100μg/只,每次免疫間隔兩周,于二免二周后取脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫學(xué)試驗(yàn)。利用夾心ELISA試驗(yàn)檢測(cè)四種蛋白作為刺激抗原活化淋巴細(xì)胞分泌IFN-y、IL-2和IL-4水平,結(jié)果顯示：Rv1985與Rv1983刺激細(xì)胞產(chǎn)生IFN-y的能力最強(qiáng),Rv1981刺激細(xì)胞產(chǎn)生IL-4的能力最強(qiáng),而產(chǎn)生IFN-y能力在所有蛋白中最弱。 為評(píng)價(jià)上述蛋白抗原在牛結(jié)核血清學(xué)診斷中的潛能,我們進(jìn)行了刺激試驗(yàn)：將Rv1981、 Rv1983、Rv1985、Rv1986四種融合蛋白純化產(chǎn)物作為包被抗原,通過(guò)間接ELISA方法檢測(cè)臨床采集牛血漿上清中特異性抗體,結(jié)果顯示陽(yáng)性符合率分別為：Rv1981為22%(15/68)、Rv1983為35.3%(24/68)、Rv1985為36.7%(25/68)及Rv1986為32.4%(22/68)。四種蛋白中,Rv1985與Bovine PPD有較高的協(xié)同性,顯示該蛋白擁有較高診斷潛能。此后將上述四種融合蛋白純化產(chǎn)物作為刺激劑刺激奶牛外周血,IFN-y檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其活化抗原特異性細(xì)胞產(chǎn)生IFN-y水平,檢測(cè)的陽(yáng)性符合率分別為30%(6/20)、20%(4/20),50%(10/20)及35%(7/20),顯示在牛結(jié)核血清學(xué)檢測(cè)中,該四種蛋白具有一定應(yīng)用潛能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R378.911

【參考文獻(xiàn)】

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1 吉清,何鳳田;包涵體復(fù)性的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè);2004年06期

2 彭哲;朱朝敏;;結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)研究進(jìn)展[J];重慶醫(yī)學(xué);2011年01期

3 朱紅裕;李強(qiáng);;外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)策略[J];過(guò)程工程學(xué)報(bào);2006年01期

4 井申榮;鄒全明;洪愉;毛旭虎;;重組人IL-10融合蛋白的表達(dá)及其生物學(xué)活性測(cè)定[J];免疫學(xué)雜志;2006年04期

5 邱燕;孫九如;黃陽(yáng)濱;黃智華;陳霖杰;劉勇;林躍鑫;;重組人IL-4大腸桿菌表達(dá)與純化[J];生物工程學(xué)報(bào);2006年06期

6 楊曉儀,林鍵,吳文言;重組蛋白包涵體的復(fù)性研究[J];生命科學(xué)研究;2004年02期

7 ;英國(guó)研制出新的牛結(jié)核病診斷方法[J];中國(guó)動(dòng)物保健;2007年12期

8 胡茂志,焦新安,潘志明,劉業(yè)兵,邵國(guó)青,劉秀梵;豬肺炎霉形體單克隆抗體的制備與鑒定[J];中國(guó)獸醫(yī)科技;2004年12期

9 張海峰;盛偉華;繆競(jìng)誠(chéng);謝宇鋒;李麗娥;馬麗麗;莊文卓;楊吉成;;重組人IL-18在大腸桿菌中的表達(dá)及其抗腫瘤作用[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2006年02期

10 蘭德松;;牛結(jié)核病診斷技術(shù)研究概況[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘;2011年02期

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本文編號(hào)：2475039