【摘要】：銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)俗稱綠膿桿菌,屬革蘭陰性桿菌,廣泛分布于水、空氣、土壤及醫(yī)院環(huán)境中,同時也是人體的正常菌群。本菌的感染多見于皮膚粘膜受損部位,如燒傷、創(chuàng)傷等,也見于因長期化療或使用免疫抑制劑的患者。在醫(yī)源性感染中由本菌引起者約占10%,在某些特殊病房中,如燒傷和腫瘤病房、各種導(dǎo)管和內(nèi)窺鏡的治療與檢查室內(nèi),本菌感染率可高達(dá)30%。它是一種能引起急慢性感染的機會致病菌,特別是引起肺部感染。它是引起囊性肺纖維化、彌漫性泛支氣管炎及支氣管擴張癥等病人死亡的主要病原體。由于其對抗生素的耐藥性使其感染幾乎不可能被清除而導(dǎo)致肺衰竭最終導(dǎo)致死亡。這促使人們開始致力于研究其感染的機制,從而從根本上尋找新的抗感染途徑。 近年來的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可以根據(jù)特定信號分子的濃度來監(jiān)測周圍環(huán)境中自身的數(shù)量變化,當(dāng)信號分子達(dá)到一定的閾值濃度時,可與相應(yīng)受體結(jié)合,激活菌體中相關(guān)基因的表達(dá)來適應(yīng)環(huán)境中的變化,完成這一信號傳導(dǎo)的普遍存在于革蘭陰性菌和革蘭陽性菌中的系統(tǒng)被稱為細(xì)菌密度感知信號(Quorum-sensing,QS)系統(tǒng)。在革蘭陰性菌中,對QS系統(tǒng)研究最為深入的是銅綠假單胞菌,該菌的信號系統(tǒng)在調(diào)控銅綠假單胞菌各種毒力因子表達(dá)中起重要作用。隨著對該系統(tǒng)的深入研究,已經(jīng)證實細(xì)菌細(xì)胞間信號系統(tǒng)是由參與毒力基因表達(dá)的調(diào)控多基因組成的,同時也明確了細(xì)胞間信號系統(tǒng)基因群是一個復(fù)雜的級聯(lián)系統(tǒng)。這個級聯(lián)系統(tǒng)包括兩個主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子lasR和rhlR和幾個其它組成元素。近年來又發(fā)現(xiàn)了銅綠假單胞菌的由QS系統(tǒng)控制并且調(diào)控lasB的轉(zhuǎn)錄的喹諾酮信號級聯(lián)系統(tǒng)。 目前的研究成果表明,Las系統(tǒng)在銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)中位于信號級聯(lián)系統(tǒng)的頂層。LasR-3-oxo-C12-HSL復(fù)合物可以正向調(diào)控rhlR和rhlI的轉(zhuǎn)錄;喹諾酮信號系統(tǒng)中的醌類物質(zhì)(PQS)是連接Las系統(tǒng)和Rhl系統(tǒng)的紐帶。不論在哪一個細(xì)胞間信號系統(tǒng)中,Las系統(tǒng)均處于中心地位。當(dāng)細(xì)菌密度較低的時候,僅產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的3-oxo-C12-HSL,當(dāng)密度升高時,3-oxo-C12-HSL亦隨之升高直至閾值濃度,此時3-oxo-C12-HSL便和LasR結(jié)合,LasR-3-oxo-C12-HSL復(fù)合體主導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控并激活下游特定基因的轉(zhuǎn)錄,從而激活包括綠膿菌素等在內(nèi)的一系列致病因子的表達(dá)。近年來已有研究提示密度感知系統(tǒng)本身就可能是一種毒力因子,并且可以直接作用于宿主細(xì)胞,抑制宿主免疫反應(yīng),從而導(dǎo)致機體更易于被感染。綜合以前學(xué)者的研究討論工作,強烈提示信號分子能夠改變銅綠假單胞菌感染后的宿主免疫反應(yīng)并可能是宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。 宿主體內(nèi)存在著比較完善的免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞以及免疫分子組成。在感染免疫過程中,各免疫器官、組織、細(xì)胞和免疫分子間互相協(xié)作、互相制約、密切配合,共同完成復(fù)雜的免疫防御功能。而致病菌侵入人體后,首先遇到的是固有免疫功能的抵御。固有免疫主要由組織屏障和某些免疫細(xì)胞、免疫分子等組成。而巨噬細(xì)胞作為機體重要的分泌細(xì)胞因子的固有免疫應(yīng)答細(xì)胞,具有吞噬顆粒性抗原及吞飲可溶性抗原的作用。此外,巨噬細(xì)胞作為炎癥階段的主要吞噬細(xì)胞,負(fù)責(zé)清除機體損傷處組織和細(xì)胞的壞死碎片以及病原體等,這些物質(zhì)對創(chuàng)傷愈合過程都有重要的調(diào)控作用。因此,巨噬細(xì)胞的活化對于機體早期抗感染免疫具有一定作用。故以巨噬細(xì)胞凋亡和吞噬等細(xì)胞行為學(xué)變化為研究靶點,可成為篩選和開發(fā)新型免疫調(diào)節(jié)藥物的新策略。我們通過化學(xué)合成銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號分子3-oxo-C12-HSL分子,觀察其對小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7的基本生物效應(yīng),為進(jìn)一步研究細(xì)菌與宿主之間相互作用提供初步實驗依據(jù)。 本研究工作分以下二個部分: 一、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號分子3-oxo-C12-HSL對小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞活力及凋亡影響的檢測 1、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號分子3-oxo-C12-HSL對小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞活力影響的檢測 挑選一瓶狀態(tài)好的細(xì)胞用0.25%的胰酶消化吹打混勻成密度約為8×10~6/ml的細(xì)胞懸液,以200μL/孔的量接種到96孔培養(yǎng)板中(周邊孔用PBS填充)37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后,細(xì)胞貼壁生長,將孔板中的培養(yǎng)基棄去,加入不含胎牛血清的DMEM200μL/孔,各孔分別加入信號分子3-oxo-C12-HSL使其終濃度為100,50,25,12.5,6.25μM及對照孔(加等量的DMSO),每組設(shè)6個復(fù)孔,信號分子3-oxo-C12-HSL作用2h或4h后吸去孔中培養(yǎng)基,用PBS洗兩遍,然后加入180μL/孔不含胎牛血清的DMEM并同時加入20μL/孔MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4h,4h后將上清棄去,每孔加入DMSO150μL,低速振蕩10min,使結(jié)晶充分溶解后在酶標(biāo)儀上測各孔的OD490nm。通過得到的各孔OD值的大小間接反映各孔細(xì)胞的活力。 2、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號分子3-oxo-C12-HSL對小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響 挑選一瓶狀態(tài)好的細(xì)胞用0.25%的胰酶消化吹打混勻成密度合適的細(xì)胞懸液(8×106/ml),以3ml/孔的量接種到6孔板中37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后,細(xì)胞貼壁生長,將孔板中的培養(yǎng)基棄去,加入新鮮的培養(yǎng)基同時加入信號分子3-oxo-C12-HSL使其終濃度為100,50,25,12.5,6.25μM及對照孔(加等量的DMSO),作用4h后按照AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)凋亡檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)及Caspase 3,8,9活性檢測試劑盒說明操作,分別上流式、酶標(biāo)儀或熒光顯微鏡檢測結(jié)果,比較不同濃度信號分子引起細(xì)胞的凋亡情況。 二、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號分子3-oxo-C12-HSL對小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞吞噬功能的影響 1、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號分子3-oxo-C12-HSL對小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞吞飲中性紅的影響 挑選一瓶狀態(tài)好的細(xì)胞用0.25%的胰酶消化吹打混勻成密度約為8×106/ml的細(xì)胞懸液,以200μL/孔的量接種到96孔培養(yǎng)板中(周邊孔用PBS填充)37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后細(xì)胞貼壁,加入信號分子3-oxo-C12-HSL使其終濃度為100,50,25,12.5,6.25μM及對照孔(加等量的DMSO),繼續(xù)孵育2h,棄去培養(yǎng)基加入中性紅生理鹽水(0.7%)200μL/孔37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h,用PBS洗三次,然后加入細(xì)胞裂解液200μL/孔,4℃過夜。酶標(biāo)儀測定各孔的OD490nm。間接反映各孔細(xì)胞對中性紅的吞飲能力。 2、銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號分子3-oxo-C12-HSL對小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7吞噬銅綠假單胞菌的影響 挑選一瓶狀態(tài)好的細(xì)胞用0.25%的胰酶消化吹打混勻成密度合適的細(xì)胞懸液(8×106/ml),以3ml/孔的量接種到6孔板中37℃5%CO_2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后,細(xì)胞貼壁生長,將孔板中的培養(yǎng)基棄去,加入新鮮的培養(yǎng)基同時加入信號分子3-oxo-C12-HSL使其終濃度為100,50,25,12.5,6.25μM及對照孔(加等量的DMSO),作用2h,然后加入0.2ml/孔的PAO1生理鹽水銅綠假單胞菌懸液(銅綠假單胞菌數(shù)量與細(xì)胞數(shù)的比例約為100:1),與細(xì)胞37℃共孵育1h后用PBS充分洗三次,瑞氏染色后在油鏡下觀察計數(shù)分別得到吞噬率和吞噬指數(shù)。 結(jié)論:本研究通過對加不同濃度3-oxo-C12-HSL后的小鼠巨噬細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞膜、線粒體、caspase酶活性及其吞噬能力的變化,說明銅綠假單胞菌Las系統(tǒng)信號分子3-oxo-C12-HSL對小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7具有免疫抑制作用,可以降低巨噬細(xì)胞對其感染的免疫反應(yīng)。此結(jié)果為進(jìn)一步研究細(xì)菌與宿主之間相互作用提供了初步的實驗依據(jù)。如果應(yīng)用于臨床,可以成為篩選和開發(fā)新型免疫調(diào)節(jié)藥物的新策略。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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1 田維毅;王文佳;李海峰;董登祥;楊娟;;中性紅法檢測巨噬細(xì)胞吞噬功能的實驗條件的優(yōu)化[J];貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2009年02期

2 白丹;余加林;萬珍艷;李芳;李祿全;;銅綠假單胞菌生物膜懸液和藻酸鹽對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2008年04期

3 朱小敏;柴文戍;;銅綠假單胞菌感染誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡的研究[J];中國病原生物學(xué)雜志;2008年04期

4 石磊;張兵;夏春;;股骨頭壞死組織中半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J];中國微創(chuàng)外科雜志;2009年08期

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本文編號：2470339