【摘要】：在歐洲,組織工程皮膚作為一種重要的實驗動物替代工具,已經(jīng)被應(yīng)用于包括皮膚腐蝕性、刺激性、光毒性及基因毒性等在內(nèi)的多項安全性檢測,以及皮膚念珠菌病、黑素瘤等多種皮膚相關(guān)疾病模型的構(gòu)建。而在我國,關(guān)于組織工程皮膚作為動物替代方法進行化學物質(zhì)安全性檢測以及利用組織工程皮膚建立皮膚疾病模型的報道十分有限。本課題就構(gòu)建化學物質(zhì)致敏性檢測的體外模型和組織工程皮膚真菌感染模型兩方面展開研究,主要包括以下三部分內(nèi)容： 第一部分組織工程皮膚的構(gòu)建 目的構(gòu)建組織工程真皮、組織工程表皮及組織工程皮膚(全層)。 方法1.利用原代培養(yǎng)的成纖維細胞與含有10%胎牛血清和10%DMEM的牛膠原溶液混合孵育,液下培養(yǎng)3d構(gòu)建組織工程真皮； 2.以成纖維細胞的動態(tài)培養(yǎng)為飼養(yǎng)層,分別氣液界面培養(yǎng)角質(zhì)形成細胞和HaCaT細胞,或氣液界面培養(yǎng)角質(zhì)形成細胞和黑素細胞,培養(yǎng)10d構(gòu)建組織工程表皮； 3.液下培養(yǎng)含成纖維細胞的膠原凝膠3d后,在其表面分別接種角質(zhì)形成細胞和HaCaT細胞,或者角質(zhì)形成細胞和黑素細胞,氣液界面培養(yǎng)10d構(gòu)建組織工程皮膚(全層)；所有培養(yǎng)物用常規(guī)石蠟包埋切片方法制備組織切片,通過蘇木精-伊紅染色觀察培養(yǎng)物的組織結(jié)構(gòu)；不含色素的組織工程表皮角蛋白免疫組化染色,含色素的表皮和皮膚S100免疫組化染色。 結(jié)果1.成功建立組織工程真皮,其外觀形態(tài)為淡紅色半透明膠狀,具有一定韌性和彈性,HE染色顯示膠原呈束狀分布,結(jié)構(gòu)致密,成纖維細胞呈梭形平行于上表面； 2.成功建立不含或者含色素的組織工程表皮,蘇木精-伊紅染色觀察,表皮細胞形成多達十余層結(jié)構(gòu)的表皮,HaCaT構(gòu)建者較角質(zhì)形成細胞構(gòu)建者表皮層數(shù)更多,但表皮內(nèi)存在空泡；K1/K10角蛋白免疫組化染色中,隨著細胞層數(shù)的增加,角質(zhì)形成細胞構(gòu)建者K1/K10角蛋白染色陽性逐漸增強,而HaCaT構(gòu)建者為陰性,K5/K14角蛋白免疫組化染色中,兩者均為陽性；含色素的組織工程表皮S100染色可見隨著培養(yǎng)時間的延長,黑素細胞由最初分布于基底層及上方發(fā)展到表皮全層均有分布；3.不含色素的組織工程皮膚HE染色顯示,角質(zhì)形成細胞和HaCaT細胞生長分化均形成具有十余層細胞結(jié)構(gòu)的表皮,但后者表皮結(jié)構(gòu)不如前者有序,細胞形態(tài)變化不如前者規(guī)律,且HaCaT構(gòu)建的表皮層較角質(zhì)形成細胞構(gòu)建者更易從真皮表面脫落；含有色素的角質(zhì)形成細胞和黑素細胞共同構(gòu)建組織工程皮膚在宏觀形態(tài)上,隨著培養(yǎng)時間的延長,培養(yǎng)物表面的顏色逐漸加深,色素顆粒增多；S100染色顯示隨著培養(yǎng)時間的延長,黑素細胞的分布從基底層逐漸發(fā)展到角質(zhì)層。 結(jié)論本研究成功建立了組織工程真皮、表皮和皮膚(全層),為今后皮膚相關(guān)化學物質(zhì)的安全性評價,皮膚疾病相關(guān)機制的研究及多種藥物的藥效學研究提供了有利工具。 第二部分致敏性體外模型的構(gòu)建 目的構(gòu)建角質(zhì)形成細胞/THP-1細胞共培養(yǎng)模型和含色素的組織工程表皮與THP-1細胞的三維分室共培養(yǎng)模型用于化學物質(zhì)的致敏性檢測。 方法1.將THP-1細胞與角質(zhì)形成細胞進行分室共培養(yǎng),濃度為0.1×,0.5x和1×最小ICso的待檢測物質(zhì)作用24h后,流式細胞儀檢測THP-1細胞表面的CD86和CD54表達水平；2.將THP-1細胞培養(yǎng)于含色素的組織工程表皮下方的培養(yǎng)液內(nèi),用0.1×ICso的待檢物質(zhì)凝膠作用于組織工程皮膚表面,24h后,流式細胞儀檢測THP-1細胞表面的CD86和CD54表達水平,用ELISA法測定培養(yǎng)液中IL-1p、IL-6和IL-8含量。 結(jié)果1.致敏物質(zhì)二硝基氯苯、苯二胺、甲醛、硫酸鎳、丁香酚、異丁香酚可誘導(dǎo)THP-1表面的共刺激分子CD86和CD54不同程度的表達,而被非致敏物月桂基硫酸鈉、乳酸、苯扎氯銨等理后,THP-1細胞表面共刺激分子CD86和CD54與陰性對照組比較未見統(tǒng)計學差異； 2.致敏物二硝基氯苯、苯二胺、硫酸鎳、丁香酚、苯佐卡因凝膠在0.1×IC50濃度時,可明顯誘導(dǎo)THP-1細胞表面CD86和CD54的表達,非致敏物月桂基硫酸鈉、苯扎氯銨凝膠無此效應(yīng),同時僅在強效致敏物作用時,培養(yǎng)液中IL-1β含量明顯升高,在中弱效致敏物和非致敏物作用下未見明顯變化,培養(yǎng)液中IL-6和IL-8在致敏物作用組和非致敏物作用組未見明顯差異。 結(jié)論1.角質(zhì)形成細胞/THP-1細胞共培養(yǎng)模型用于檢測可溶性化學物質(zhì)的致敏性,其操作步驟簡單,靈敏度高,是一種較好的致敏性檢測方法,有較廣泛的應(yīng)用前景,其不足在于無法用于非可溶性化學物質(zhì)及制劑的檢測；2.含色素的組織工程表皮/THP-1細胞三維分室共培養(yǎng)模型的成功建立,解決了不溶性化學物質(zhì)和外用制劑的致敏性檢測的難題,它更符合變態(tài)反應(yīng)致敏階段的發(fā)生機制,有更強的可比性和可信度。 第三部分組織工程皮膚在真菌感染性皮膚病中的應(yīng)用 目的構(gòu)建白念珠菌、須癬毛癬菌、紅色毛癬菌和糠秕馬拉色菌感染的組織工程皮膚模型,為各種常見皮膚真菌病致病機制及病原菌毒力的研究及藥效學的研究提供一種新型的工具；同時,初步探討紅色毛癬菌感染的組織工程皮膚模型在抗真菌藥物藥效學評價方面的應(yīng)用。 方法1.將濃度為約1×106/ml的白念珠菌、須癬毛癬菌、紅色毛癬菌和糠秕馬拉色菌菌懸液5μl接種于含色素的組織工程皮膚表面,于35℃,5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng),分別于6h、12h、24h、48h和72h后,石蠟包埋切片,HE染色和PAS染色觀察；2.將紅色毛癬菌菌懸液加至含色素的組織工程皮膚表面,與此同時,向組織工程皮膚下方的培養(yǎng)液中分別加入0.001μg/ml,0.01μg/ml,0.1μg/ml和1μg/ml的特比萘芬溶液,48h后,石蠟包埋切片,HE染色和PAS染色觀察。 結(jié)果1.白念珠菌、須癬毛癬菌和紅色毛癬菌組中可見菌絲及孢子隨著時間的推移,漸漸侵入表皮層甚至真皮層,同時真菌對皮膚產(chǎn)生明顯的破壞作用,而糠秕馬拉色菌僅生長于表皮層上方或表皮淺層,對皮膚的破壞作用不明顯；2.在紅色毛癬菌感染模型中,隨著特比萘芬濃度的升高,紅色毛癬菌的菌絲侵入數(shù)量減少,對皮膚的破壞程度逐漸減輕。 結(jié)論成功建立了白念珠菌感染的組織工程皮膚模型、須癬毛癬菌感染的組織工程皮膚模型、紅色毛癬菌感染的組織工程皮膚模型和糠秕馬拉色菌感染的組織工程皮膚模型,有利于上述常見皮膚真菌體外模型的發(fā)展；通過研究特比萘芬對紅色毛癬菌感染的組織工程皮膚模型的干預(yù)作用,提示今后抗真菌藥物的體外藥效學評價可以菌絲侵入程度的變化及皮膚破壞程度的嚴重程度為指標,作為一種新型的體外模型,親人性紅色毛癬菌感染的組織工程皮膚模型對臨床用抗真菌藥物及抗真菌新藥的藥效學評價有極為重要的價值。
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【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻】

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