【摘要】：目的：(1)探討C02激光打標機處理的有序排列微模板培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細胞的生長特征及其細胞生物學變化。(2)探索角膜上皮、口腔黏膜上皮細胞在UpCellTM溫敏型表面培養(yǎng)皿上的合適接種密度及生長特性,利用溫敏特性獲得無載體細胞片以及構(gòu)建口腔黏膜上皮細胞片的意義。(3)探討重組Maxadilan(MAX)對角膜基質(zhì)微環(huán)境下培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細胞的CK3表達的影響；不同濃度的MAX對角膜基質(zhì)細胞的影響。 方法：(1)用CO2激光打標機刻制的聚苯乙烯有序排列微模板培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細胞,模板溝槽劃線間隔距離0.25mmm者為窄間隔組,間隔距離1mm者為寬間隔組,平板組作為對照組。將角膜基質(zhì)細胞懸液1×105/ml細胞密度接種于培養(yǎng)板,倒置顯微鏡下每日觀察細胞生長情況、HE染色觀察細胞排列的形態(tài)學差異、免疫熒光法檢測培養(yǎng)板上細胞的波形蛋白、實時監(jiān)測顯微鏡下觀察24h窄間隔組細胞的接觸指引特性及細胞的動態(tài)生長過程。(2) UpCellTM溫敏型表面培養(yǎng)皿及普通培養(yǎng)皿上接種不同密度的原代兔角膜上皮、口腔黏膜上皮細胞,置于37℃,5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。通過倒置顯微鏡觀察兩種細胞在溫敏培養(yǎng)皿上生長狀況、形態(tài)學差異,同時尋求合適的接種密度；吖啶橙染色顯示即將獲取細胞片的活性；獲取細胞片后石蠟切片HE染色以及掃描電鏡觀察細胞片的結(jié)構(gòu)。(3)用RT-PCR檢測PAC1受體在角膜基質(zhì)細胞中的表達情況；Western-Blot檢測PACl受體在角膜上皮細胞、角膜基質(zhì)細胞及口腔粘膜上皮細胞中的表達檢測；采用普通培養(yǎng)法及24h饑餓法分別添加不同濃度的MAX,培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細胞,運用CCK8檢測MAX對角膜基質(zhì)細胞的促增殖作用；用免疫熒光定量Real-TimePCR檢測以下4組細胞角蛋白CK3的表達差異：第一組,口腔黏膜上皮細胞+角膜基質(zhì)細胞(通過插入式培養(yǎng)皿)。第二組,口腔黏膜上皮細胞+角膜基質(zhì)細胞+100nM MAX。第三組,單純口腔黏膜上皮細胞。第四組,單純角膜上皮細胞。 結(jié)果：(1)培養(yǎng)第1天倒置顯微鏡下見角膜基質(zhì)細胞貼壁生長,窄間隔組和寬間隔組細胞逐漸圍繞溝槽接觸指引生長,表現(xiàn)為有序排列,且窄間隔組較寬間隔組明顯。HE染色與免疫熒光染色顯示培養(yǎng)細胞在窄間隔組溝槽的接觸指引下呈有序排列,呈現(xiàn)10余層細胞排列的平行板層結(jié)構(gòu)。3組細胞波形蛋白免疫熒光染色均呈陽性反應。實時監(jiān)測顯微鏡下可見窄寬間隔組細胞體部首先貼壁,在接觸指引下生長,而細胞在干燥環(huán)境下的凋亡始于細胞偽足突起處。(2)不同密度接種于UpCellTM溫敏型表面培養(yǎng)皿及普通培養(yǎng)皿中的原代兔角膜上皮、口腔黏膜上皮細胞,早期沒有表現(xiàn)出形態(tài)學上的差別,且在溫敏型表面培養(yǎng)皿及普通培養(yǎng)皿中生長狀況一致。隨時間延長5×104/ml密度細胞生長緩慢,2×105/ml密度的細胞容易出現(xiàn)凋亡態(tài),1×105/ml密度接種細胞出現(xiàn)鋪路石狀細胞,有較多細胞克隆中心形成,細胞呈復層,8天后生長狀態(tài)最佳。20℃-25℃低溫培養(yǎng)后見培養(yǎng)皿的局部有細胞片脫離溫敏材料的表面,呈卷曲狀,隨時間延長發(fā)現(xiàn)脫離的細胞片越來越大,石蠟切片HE染色細胞呈復層,掃描電鏡觀察細胞片細胞間交錯連接明顯,排列緊密。(3)RT-PCR證實角膜基質(zhì)細胞上有PAC1受體的表達,Western-Blot證實角膜上皮細胞、角膜基質(zhì)細胞及口腔黏膜上皮細胞上PAC1受體的表達陽性；CCK8細胞增殖實驗顯示MAX對角膜基質(zhì)細胞有促進作用；Real-Time PCR證實MAX促進與角膜基質(zhì)細胞共培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細胞的CK3表達。 結(jié)論：(1)利用CO2激光打標機制備的有序排列微模板可獲得有序排列角膜基質(zhì)細胞,有利于在接近于生理狀態(tài)條件下角膜基質(zhì)層的構(gòu)建。(2)UpCellTM溫敏型表面培養(yǎng)皿獲取無載體細胞片,符合構(gòu)建生理狀態(tài)的角膜上皮層的要求。(3)角膜上皮細胞、角膜基質(zhì)細胞及口腔黏膜上皮細胞均表達]PAC1受體；PAC1受體激動劑Maxadilan對角膜基質(zhì)細胞具有促增殖作用,并促進口腔黏膜上皮細胞CK3的表達,Maxadilan有利于組織工程角膜種子細胞的生長。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R314

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4 劉s，

本文編號：2464176