【摘要】：目的構(gòu)建體外定向誘導(dǎo)的小鼠血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)向成骨樣細(xì)胞分化的細(xì)胞模型,為本系列研究奠定基礎(chǔ)。 方法VSMC使用含10mMβ-甘油磷酸鈉(P-glycerophosphate disodium, β-GP)的培養(yǎng)基培養(yǎng),定向誘導(dǎo)原代小鼠VSMC分化為成骨樣細(xì)胞,在細(xì)胞培養(yǎng)的0天、12天分別提取總RNA做逆轉(zhuǎn)錄,熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor2, Runx2)、骨鈣素(osteocalcin, OC)、骨橋蛋白(osteopontin, OPN) mRNA的表達(dá)水平；檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性；進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)染色。分別在細(xì)胞培養(yǎng)的0天、3天、8天、12天提取總蛋白做Western Blot,觀察平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物平滑肌肌動(dòng)蛋白a (smooth muscle alpha-actin, SMα-actin)及Runx2蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果VSMC經(jīng)過12天誘導(dǎo)后,β-GP可增強(qiáng)Runx2、OC、OPN mRNA的表達(dá),提高ALP活性,促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成,增強(qiáng)Runx2蛋白的表達(dá),并抑制SMa-actin蛋白的表達(dá)。 結(jié)論本研究成功構(gòu)建了小鼠VSMC成骨樣分化的細(xì)胞模型。β-GP增強(qiáng)成骨細(xì)胞表型基因Runx2、OC、OPN mRNA表達(dá)；增強(qiáng)Runx2蛋白表達(dá)；抑制平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志物SMa-actin蛋白表達(dá)。β-GP的誘導(dǎo)作用具有時(shí)間依賴性特征。 目的檢測VSMC成骨樣分化前后以及5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC)干預(yù)后Runx2基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài),觀察5-Aza-dC對(duì)VSMC成骨樣分化過程中Runx2表達(dá)的影響,探討Runx2甲基化狀態(tài)影響VSMC成骨樣分化過程的機(jī)制。 方法提取對(duì)照組VSMC的DNA,通過亞硫酸氫鈉測序,確定Runx2基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。用MTT法檢測5-Aza-dC對(duì)VSMC增殖的影響,獲得適宜的干預(yù)濃度。將小鼠VSMC暴露于含有不同濃度的5-Aza-dC礦化培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天,分別抽提VSMC的總RNA和總蛋白,觀察Runx2在mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況；用含相同濃度5-Aza-dC(15μM)的礦化培養(yǎng)基干預(yù)VSMC,在細(xì)胞培養(yǎng)的0天、3天、8天和12天分別抽提總RNA做逆轉(zhuǎn)錄,熒光實(shí)時(shí)定量PCR觀察Runx2mRNA表達(dá)情況,Western Blot觀察Runx2在蛋白水平的表達(dá)。 分別提取10mM β-GP誘導(dǎo)12天及15μM5-Aza-dC聯(lián)合10mM P-GP干預(yù)12天VSMC的DNA,通過亞硫酸氫鈉測序,確定Runx2基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。 結(jié)果對(duì)照組VSMC的Runx2基因啟動(dòng)子呈高甲基化狀態(tài)。20μM5-Aza-dC干預(yù)VSMC24小時(shí)后,細(xì)胞密度較對(duì)照組顯著降低(P0.05)。低于20μM的5-Aza-dC(5,10,15μM)是適宜的干預(yù)濃度并用于后續(xù)的研究o5-Aza-dC上調(diào)VSMC的Runx2表達(dá),且對(duì)Runx2表達(dá)的影響呈劑量和時(shí)間依賴效應(yīng),5-Aza-dC干預(yù)的最佳濃度為15μM。 亞硫酸氫鈉測序結(jié)果顯示,10mM β-GP誘導(dǎo)12天后,Runx2基因啟動(dòng)子甲基化水平較對(duì)照組明顯降低；15μM5-Aza-dC聯(lián)合10mM β-GP干預(yù)12天后,Runx2基因啟動(dòng)子甲基化水平較誘導(dǎo)組和對(duì)照組均顯著降低。 結(jié)論VSMC向成骨樣細(xì)胞分化后,Runx2基因啟動(dòng)子甲基化水平降低；5-Aza-dC干預(yù)后,Runx2基因啟動(dòng)子甲基化水平進(jìn)一步降低。5-Aza-dC通過降低Runx2基因啟動(dòng)子甲基化水平,上調(diào)Runx2的表達(dá),呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)。Runx2基因啟動(dòng)子去甲基化可能促進(jìn)VSMC成骨樣分化。 目的vaspin(visceral adipose tissue-derived serpin)是一種新近發(fā)現(xiàn)的由內(nèi)臟脂肪組織分泌的脂肪因子,具有增強(qiáng)胰島素敏感性的作用。近期的研究發(fā)現(xiàn)vaspin通過PI3-K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。但vaspin的主要生理作用及相關(guān)機(jī)制仍不明確。本研究首次檢測vaspin對(duì)人成骨細(xì)胞(human osteoblast, hOB)凋亡的影響,并探討vaspin對(duì)hOB凋亡的作用機(jī)制。 方法用ELISA法和TUNEL法測定hOB凋亡情況。應(yīng)用Western blot分析vaspin對(duì)hOB細(xì)胞Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響。應(yīng)用Western blot檢測vaspin干預(yù)后p-ERK1/2, ERK1/2, p-JNK, JNK, p-p38, p38, p-Akt和Akt的表達(dá)。用ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑PD98059干預(yù),觀察vaspin對(duì)hOB凋亡的作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。 結(jié)果(1)vaspin可抑制hOB凋亡。(2)vaspin促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá),抑制Bax蛋白表達(dá),均呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。(3)vaspin干預(yù)可誘導(dǎo)ERK磷酸化,MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑PD98059能阻斷vaspin對(duì)ERK的活化作用；vaspin對(duì)p38、JNK和Akt磷酸化無影響。(4)PD98059能抑制vaspin對(duì)hOB凋亡的抑制作用。 結(jié)論vaspin通過MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制hOB凋亡
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2460672